Knowledge base: Warsaw University of Technology

Settings and your account

Back

Development of HPLC-Chip/ESI QqQ MS method for the identyfication of organic dyestuffs

Iwanowska Joanna

Abstract

Introduction Coupled techniques are widely used in medicine, pharmacy, chemistry or biochemistry. The combination of liquid chromatography and mass spectrometry (LC–MS) offers great capabilities, including the identification of components of complex mixtures, such as organic dyes. A miniaturized high performance liquid chromatography (HPLC-chip) is a new solution which can reduce the volume of the analyzed sample up to ten times (less than 1 μL). HPLC-chip minimizes problemswith coupling individual elements, shortens analytes wayto the detector and increases ionization efficiency. This technology coupled with tandem mass spectrometry (MS/MS) limits the amount of collected samples and increases sensitivity of the analysis. As a result it makes a powerful tool for the identification of dyes in a work of art. The purpose of this study was to develop a method for identification of early synthetic organic dyes using a combination ofminiaturized high performance liquid chromatography and mass spectrometerwith electrospray ionization and triple quadrupole analyzer (HPLC-chip–ESI QqQ MS). The performed research included the determination of optimalconditions of separation and ionization process and the statistical characteristics of the method. Measurement Standard solutions were analyzed by HPLC–ESIQ MS in the SCAN mode to selectmother ions for further analysis. Composition of mobile phase and optimal parameters ofionization were established for HPLC-chip–ESIQqQ MS set, whileoptimization offragmentatorvoltage and collisions energy of individual ions were performedusing MassHunter Optimizer software. Finally,calibration curvesforthe synthetic dyes were plotted based on the chromatogramsregistered in the metastable reaction monitoring (MRM) mode. It allowed to define detection and determination limits of the colorants. Observations and Conclusions The adventages of HPLC-chip–-ESIQQQ MS technique is high sensitivity, which in consequence allows to determine content of colorants in the analyzed material at a level of pg·mL-1. The method can be used for the identification of components of complex mixtures of dyesbasing on the mass spectra, which are unique for each compound, even if it is impossible to separate all the components. Daughter ions registered during optimization of fragmentatorvoltage and collision energy allowed to determine fragmentation pathways of the colorants which in future may facilitate identification of dyes in the material of unknown origin. Among observed,there were characteristic losses of phenyl group from triphenylmethane dyes, ester group from rhodamine 6G and primary, secondary and tertiary amino group in methylene red, rosanilinie, brilliant cresyl blue, methylene blueand rodamins. For the separation of compounds of interest a gradient of acetonitrile in the mobile phase was optimized. The process was carried out in two ways: by increasing the initial content or faster growth of the content of organic solvent. The disadvantage of the former attempt wasan increase in peaks width at half-height of the compounds retaininglonger. Also an equilibration time affected separation. In the case of compounds eluting under 2 min longertime resulted in peaks broadening, unlike the colorantsretaining at the column longer than 3 min. An addition of formic acid to the eluent was chosen mainly based on considerablyhigher intensity of signals which was due to the much more efficient ionization of the molecules. However,the use of a weaker acid resulted in the extensionof the peak tailing. Formic acid caused longer retention times of most of examined dyes, except azo dyes, eluted at shortertime. Lack of an acid allowed the separation of rhodamine B and rhodamine 6G, but high background levels adversely affected the S/N ratio of the other compounds. The shape of the sprayed effluent stream was regulated by a proper position of a spray needle and a optimal ionization voltage, within 1550-1850 V and largely depended on other factors (e.g. pressure). In addition, the drying gas flow also affected the S/N ratio of the ions. The studyallowed to establish optimal conditions of ionization, separation and detection of the analyzed compound. Itwas chosen: a gradient elutionwith increase of acetonitrile content from 13 to 90% in 12 min, an addition of formic acid at 0.1% to the mobile phase, an equilibration time at 10 min and a drying gas flow at 6 L·min-1
Record ID
WUTe91eba91386d4a34bce515438bbe93ca
Diploma type
Master of Science
Author
Iwanowska Joanna Iwanowska Joanna,, Undefined Affiliation
Title in Polish
Opracowanie metody identyfikacji barwników organicznych za pomocą technologii HPLC-Chip/ESI QqQ MS
Supervisor
Maciej Jarosz (FC/CAC) Maciej Jarosz,, Chair Of Analytical Chemistry (FC/CAC)Faculty of Chemistry (FC)
Certifying unit
Faculty of Chemistry (FC)
Affiliation unit
Chair Of Analytical Chemistry (FC/CAC)
Study subject / specialization
, Technologia Chemiczna
Language
(pl) Polish
Status
Finished
Defense Date
28-02-2012
Issue date (year)
2012
Keywords in Polish
-
Keywords in English
-
Abstract in Polish
Wprowadzenie Techniki łączone znajdują szerokie zastosowanie w medycynie, farmacji, chemii czy biochemii. Połączenie chromatografii cieczowej (ang. Liquid Chromatography, LC) ze spektrometrią mas (ang. Spectrometry Mass, MS) umożliwia identyfikację związków wchodzących w skład złożonych mieszanin, jakimi są barwniki organiczne. Nowym rozwiązaniem jest zminiaturyzowana wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC-chip), która pozwala zmniejszyć nawet dziesięciokrotnie objętość analizowanego roztworu (poniżej 1 μL). Konstrukcja HPLC-chip minimalizuje problemy związane z łączeniem poszczególnych elementów, skraca drogę analitu do detektora i zapewnia większą wydajność jonizacji. Technologia ta w połączeniu z tandemową spektrometrią mas (ang. Tandem Mass Spectrometry, MS/MS) ogranicza ilość pobieranej próbki oraz zapewnia większą czułość analiz, stanowiąc tym samym doskonałe narzędzie do identyfikacji barwników w dziełach sztuki. Celem niniejszej pracy było opracowanie metody identyfikacji wczesnych syntetycznych barwników organicznych za pomocą zminiaturyzowanej wysokosprawnej chromatografii cieczowej połączonej ze spektrometrią mas z jonizacją poprzez elektrorozpylanie z potrójnym analizatorem kwadrupolowym (HPLC-chip–ESI QqQ MS). Praca obejmowała określenie optymalnych parametrów rozdzielania, jonizacji i oznaczania powstałych jonów oraz charakterystykę statystyczną opracowanej metody. Pomiary W pierwszym etapie przy użyciu HPLC–ESI Q MS w trybie SCAN przeprowadzono analizy wzorców w celu wybrania jonów macierzystych do dalszych analiz. Następnie przy użyciu HPLC-chip–ESI QqQ MS ustalono skład fazy ruchomej i optymalne warunki rozpylania, a przy użyciu programu MassHunter Optimizer dokonano optymalizacji napięcia fragmentatora i energii kolizjiposzczególnych jonów. W ostatnim etapie na podstawie przeprowadzonych analiz chromatograficznych w trybie monitorowania reakcji następczych (MRM) sporządzono krzywe kalibracjioraz wyznaczono granice wykrywalności i oznaczalności barwników syntetycznych. Obserwacje i wnioski Technika HPLC-chip–ESI QqQ MS odznacza się dużą czułością, co pozwalało na oznaczenie związków barwiących w próbce o stężeniach rzędu pg·mL-1. Opracowana metoda może być wykorzystana do identyfikacji złożonych mieszanin barwnikówna podstawie unikatowych dla każdego związku widm mas, nawet jeżeli niemożliwe jest rozdzielenie wszystkich jej składników. Jony potomnyce rejestrowane w optymalnychwarunkach napięcia i energii kolizji pozwoliły określić sposób fragmentacji związków barwiących, które w przyszłości mogą ułatwić identyfikację barwników w materiale nieznanego pochodzenia. Zaobserwowano m.in. charakterystyczne oderwanie grupy fenylowej w barwnikach trifenylometanowych, grupy estrowej w rodaminie 6G oraz I-, II-, III-rzędowej grupy aminowej w czerwieni metylenowej, rodaminach, błękicie jaskrawym, rozanilinie i błękicie metylenowym. Rozdzielenie związków możliwe było dzięki ustaleniu odpowiedniego gradientu acetonitrylu w fazie ruchomej. Zmiany prowadzono na dwa sposoby: przez zwiększenie początkowej zawartości lub szybszy wzrost udziału fazy organicznej w czasie. Wadą pierwszego sposobu było zwiększenie szerokości połówkowej pików dla związków eluujących w dłuższym czasie. Podczas optymalizacji czasu kondycjonowania kolumny zaobserwowano, że w przypadku związków eluujących poniżej 2 min wydłużenie tego czasu skutkowało rozmyciem pików, odwrotnie niż to miało miejsce dla związków przebywających na kolumnie dłużej niż 3 min. O wyborze kwasu mrówkowego jako dodatku do eluentu, zadecydowała przede wszystkim znacznie większa intensywność sygnałów, która wynikała z bardziej wydajnej jonizacji cząsteczek. Zastosowanie słabszego kwasu powodowało większe ogonowanie pików. W wyniku dodawania kwasu mrówkowego do fazy ruchomej większość barwników pozostawała na kolumnie dłużej, podczas gdy barwniki azowe eluowały w coraz krótszym czasie. Nieobecność kwasu umożliwiła rozdzielenie rodaminy B i rodaminy 6G, jednak wysoki poziom tła niekorzystnie wpływał na stosunek S/N pozostałych związków. Kształt strumienia rozpylanego eluatu był regulowany przez ustalenie odpowiedniego położenia igły rozpylającej i optymalnego napięcia jonizacji, które oscylowało w granicach 1550–1850 V i w dużym stopniu zależało od innych czynników (np. ciśnienie). Ponadto przepływ gazu suszącego również wpływał na wielkość stosunku sygnału do szumu jonów. W wyniku przeprowadzonych badań określono optymalne warunki rozdzielania, jonizacjii detekcji związków. Wybrano elucję gradientową ze wzrostem zawartości acetonitrylu w wodzie od 13 do 90% w czasie 12 min, dodatek kwasu mrówkowego na poziomie 0,1% do fazy wodnej, czas kondycjonowania kolumny – 10 min i przepływ gazu suszącego – 6 L·min-1
File
  • File: 1
    Praca magisterska.pdf
Request a WCAG compliant version

Uniform Resource Identifier
https://repo.pw.edu.pl/info/master/WUTe91eba91386d4a34bce515438bbe93ca/
URN
urn:pw-repo:WUTe91eba91386d4a34bce515438bbe93ca

Confirmation
Are you sure?
Report incorrect data on this page