Knowledge base: Warsaw University of Technology

Settings and your account

Back

Cloning, purification and properties of human recombinant serine hydroxymethyltransferase

Kinga Gazda

Abstract

Serine hydroxymethyltransferase catalyses, in the presence of pyridoxal phosphate cofactor, reversible conversion of serine and tetrahydrofolate into glycine and methylenetetrahydrofolate. Serine hydroxymethyltransferase (SHMT), thymidylate synthase (TS), and dihydrofolate reductase (DHFR) catalyse thymidylate biosynthesis. SHMT catalyses formation methylenetetrahydrofolate, a cofactor in TS-catalyzed reaction. TS catalyses the reaction of deoxyuridine methylation to thymidylate, with concomitant transformation of methylenetetrahydrofolate to dihydrofolate. Thymidylate undergoes phosphorylation and is further incorporated into DNA. DHFR reduces dihydrofolate to tetrahydrofolate, being in turn the substrate for SHMT. Thymidylate biosynthesis pathway is the only source of de novo thymidylate biosynthesis, therefore enzymes involved in thymidylate biosynthesis pathway are considered anticancer, antiviral and antiprotozoal chemotherapy targets. The goal of the present studies was obtaining high overexpression of human SHMT (hSHMT) gene and purification of hSHMT protein to homogeneity. SHMT is a high molecular weight protein with numerous hydrophobic regions, so it may be quite toxic to bacterial cells. Since previous attempts to express SHMT gene, cloned into pQE2 vector in strains recommended by the manufacturer (M15[pREP4] and JM109), have failed, two additional expression E. coli strains, BL21(DE3) and BL21(DE3)pLysS, were transformed with isolated pQE2/SHMT plasmid. Optimization of gene expression in those strains showed that the protein may be efficiently produced in BL21(DE3) strain. Cultivation temperature had no effect on amount of SHMT produced and recombinant protein was produced without the inductor (IPTG) added. A part of hSHMT protein was present in the inclusion bodies, but crude extract contained a sufficient amount of soluble hSHMT protein to obtain, after optimization of purification conditions, more than 50 mg of homogenous protein from 1 l of bacterial culture. The hSHMT protein was purified in the presence and absence of phosphatase inhibitors. Storage conditions (at –20oC) were optimized (50 μM PLP, 100 μM serine, 5 mM DTT, 0,1 % Triton X–100 and 20 % saccharose). After thawing, the enzyme lost 30% of its initial activity, but in the course of repeating freezing and thawing the remaining activity was unchanged. Bioinformatic tools were used to predict potential phosphorylation sites on hSHMT protein. Those sites were identified at both conserved and non-conserved positions, located at the amino/carboxyl ends of protein sequence. Serine (12), tyrosine (20) and threonine (11) residues were found as potential phosphorylation sites. hSHMT apoenzyme was separated on alumina resin after removing of PLP from hSHMT holoenzyme. It was shown that 29% of applied hSHMT protein was not bound to the resin and only 35% protein was eluted. The presence of phosphorylated amino acid resins was not detected by staining of protein in polyacrylamide gel by Pro–Q Diamond stain.
Record ID
WUTc95c8ebefe4b440f8cfa285c1794f39e
Diploma type
Master of Science
Author
Kinga Gazda Kinga Gazda,, Undefined Affiliation
Title in Polish
Klonowanie, oczyszczanie i właściwości ludzkiej rekombinowanej hydroksymetylotransferazy serynowej
Supervisor
Joanna Cieśla (FC/CDSB) Joanna Cieśla,, Chair of Drug and Cosmetics Biotechnology (FC/CDSB)Faculty of Chemistry (FC)
Certifying unit
Faculty of Chemistry (FC)
Affiliation unit
Department Of Drug Technology And Biotechnology (FC/CDSB)
Study subject / specialization
, Mikrobioanalityka
Language
(pl) Polish
Status
Finished
Defense Date
21-06-2012
Issue date (year)
2012
Keywords in Polish
-
Keywords in English
-
Abstract in Polish
Hydroksymetylotransferaza serynowa katalizuje odwracalną reakcję przekształcenia seryny i tetrahydrofolianu w glicynę i metylenotetrahydrofolian, przy udziale kofaktora – fosforanu pirydoksalu. Hydroksymetylotransferaza serynowa (SHMT) wraz z syntazą tymidylanową (ST) i reduktazą dihydrofolianową (DHFR) katalizują cykl biosyntezy tymidylanu. SHMT katalizuje wytworzenie metylenotetrahydrofolianu, który jest kofaktorem i substratem dla enzymu ST. ST przeprowadza reakcję metylacji deoksyurydylanu do tymidylanu. Tymidylan ulega fosforylacji i jest następnie jest włączany do DNA. DHFR, redukuje dihydrofolian, powstający z metylenotetrahydrofolianu w reakcji ST, do tetrahydrofolianu, który jest substratem SHMT. Ponieważ cykl biosyntezy tymidylanu jest jedynym źródłem biosyntezy tymidylanu de novo, enzymy zaangażowane w ten cykl stały się celami molekularnymi w chemioterapii przeciwnowotworowej, przeciwwirusowej i przeciwpierwotniaczej. Badania prowadzone w niniejszej pracy miały na celu uzyskanie wysokiej nadekspresji genu i homogennego preparatu białka hSHMT. SHMT jest białkiem o dużej masie cząsteczkowej, zawierającym wiele regionów hydrofobowych i dlatego może być toksyczna dla komórek bakterii. Ponieważ wcześniejsze próby nadprodukcji białka w szczepach E.coli M15[pREP4] i JM109, polecanych przez producenta do ekspresji genów wprowadzonych w plazmid pQE2 nie powiodły się, wyizolowano plazmid pQE2/hSHMT i stransformowano inne ekspresyjne szczepy bakterii E. coli - BL21(DE3) i BL21(DE3)pLysS. Optymalizacja ekspresji genu hSHMT wykazała, że białko jest wydajniej produkowane w szczepie BL21(DE3). Nie zaobserwowano różnicy w ilości nadprodukowanego białka ludzkiej SHMT w zależności od temperatury i białko to było produkowane niezależnie od indukcji za pomocą IPTG. Stwierdzono występowanie części białka SHMT w postaci ciałek inkluzyjnych, jednak ilość białka w formie rozpuszczalnej była na tyle duża, że po zoptymalizowaniu warunków oczyszczania uzyskano ponad 50 mg homogennego preparatu z 1 l hodowli bakteryjnej. Białko oczyszczono w obecności i przy braku inhibitorów fosfataz. Dobrano warunki przechowywania białka w -20ºC: bufor zawierał związki stabilizujące enzym, takie jak 50 μM PLP, 100 μM seryna, 5 mM DTT, 0,1 % Triton X–100 oraz 20% sacharoza. Chociaż po rozmrożeniu enzym tracił 30% aktywności początkowej, jednak pozostała aktywność utrzymywała się na stałym poziomie podczas wielokrotnego zamrażania i rozmrażania preparatu. Zbadano możliwość występowania fosforylacji białka SHMT za pomocą narzędzi bioinformatycznych. Wytypowano potencjalne miejsca fosforylacji aminokwasów znajdujących się w pozycjach konserwowanych i nie konserwowanych, znajdujących się na końcu aminowym lub karboksylowym białka. Wytypowano potencjalne miejsca fosforylacji 12 reszt serynowych, 20 reszt treoninowych oraz 11 reszt tyrozynowych. Po uprzednim pozbawieniu preparatu hSHMT grupy prostetycznej, PLP, przeprowadzono rozdział preparatu białka hSHMT na złożu glinowym. Wykazano, że 29% nakładanego białka hSHMT nie ulega związaniu do złoża glinowego. Podczas procesu elucji wymyto 35% nakładanego białka hSHMT. Nie udało wymyć się pozostałej części, 30% nakładanego białka. Za pomocą barwienia w żelu poliakryloamidowym za pomocą odczynnika Pro–Q Diamond nie stwierdzono obecności ufosforylowanego białka.
File
  • File: 1
    Praca magisterska.pdf
Request a WCAG compliant version

Uniform Resource Identifier
https://repo.pw.edu.pl/info/master/WUTc95c8ebefe4b440f8cfa285c1794f39e/
URN
urn:pw-repo:WUTc95c8ebefe4b440f8cfa285c1794f39e

Confirmation
Are you sure?
Report incorrect data on this page