Optymalizacja warunków hodowli i charakterystyka enzymów lipolitycznych z drożdży Candida sp. izolowanych z biopaliw

Aleksandra Paulina Starzyk

Abstract

-
Diploma typeMaster of Science
Author Aleksandra Paulina Starzyk
Aleksandra Paulina Starzyk,,
-
Supervisor Monika Wielechowska ZTiBSL
Monika Wielechowska,,
- Department Of Drug Technology And Biotechnology
Certifying unitFaculty of Chemistry (FC)
Affiliation unitDepartment Of Drug Technology And Biotechnology (DDTB)
Study subject / specializationBiotechnologia Chemiczna - Leki i Kosmetyki
Languagepl polski
StatusFinished
Defense Date09-07-2013
Issue date (year)2013
Keywords in Polish-
Keywords in English-
Abstract in PolishWstęp W pracy opisano badania przesiewowe trzynastu lipolitycznych szczepów drożdży Candida sp. znajdujących się w kolekcji Zakładu Technologii i Biotechnologii Środków Leczniczych PW, które zostały wyizolowane z odpadów biopaliwowych. Badania przeprowadzono na podłożach stałych zawierających m.in. oliwę z oliwek jako źródło węgla, a także na podłożach stałych zawierających fluorescencyjny barwnik - Rodaminę B. Badania w podłożach stałych nie dały jednoznacznych wyników, który ze szczepów wykazuje największą produkcję lipaz, dlatego dodatkowo przeprowadzono badania aktywności ww. szczepów na pożywkach płynnych. Na ich podstawie wybrano szczep o największej zewnątrzkomórkowej aktywności lipolitycznej – szczep B2 – i przeprowadzono optymalizację warunków jego hodowli. Zbadano jaki wpływ na aktywność zewnątrzkomórkową badanego szczepu mają takie czynniki jak: rodzaj źródeł węgla i azotu w pożywce, obecność substancji zwiększających rozpuszczalność olejów, a także czas prowadzenia hodowli oraz wpływ hodowli namnażającej na hodowlę właściwą szczepu. Wyniki i dyskusja Na podstawie wyników badań stwierdzono, że pożywka namnażająca ma istotny wpływ na hodowlę właściwą szczepu B2 oraz najlepsze wyniki hodowli właściwej uzyskuje się po zaszczepieniu hodowli inokulum namnożonym na pożywce zawierającej pepton z kazeiny (0,65%), ekstrakt drożdżowy (0,45%), oliwę z oliwek (1%) oraz glukozę (0,1%). Najwyższą aktywność lipolityczną szczepu w hodowli właściwej uzyskano na pożywce zawierającej pepton z kazeiny (0,65%), ekstrakt drożdżowy (0,45%) i oliwę z oliwek (1%). Zbadano wiele źródeł węgla w hodowli właściwej, między innymi oleje takie jak olej rzepakowy, olej z pestek winogron, olej sezamowy, a także masło, oleinian metylu, kwas oleinowy i inne, ale zdecydowanie najwyższą aktywność zewnątrzkomórkową szczep B2 wykazywał w pożywkach zawierających oliwę. Najlepsze wyniki aktywności zewnątrzkomórkowej szczepu B2 uzyskiwano w drugim i trzecim dniu hodowli właściwej. Hodowle prowadzono w temperaturze 30°C. Po ustaleniu optymalnych warunków hodowli szczepu B2, z supernatantu z trzydniowej hodowli właściwej poprzez liofilizację uzyskano 0,342 g preparatu enzymatycznego o zawartości białka 6,51 mg/1g preparatu. Otrzymany preparat enzymatyczny poddano badaniom, które miały na celu określenie specyficzności substratowej enzymu, dobór najlepszych parametrów reakcji, takich jak temperatura i pH, a także zbadanie stabilności enzymu w różnych temperaturach, pH i rozpuszczalnikach organicznych. Badania wykazały, że zależnie od użytego do reakcji substratu należy dobrać osobne warunki reakcji. Spośród zbadanych estrów pNP, najlepszym okazał się oktanian pNP i dla tego substratu najkorzystniejszymi parametrami reakcji były: temperatura 30°C i pH=6,2. W tych warunkach aktywność enzymu wynosiła 94,7 U/mg białka. Stabilność enzymu badano w reakcji z maślanem pNP. Enzym był stabilny w zakresie pH od 2 do 9 i spadek jego aktywności w tym zakresie był niewielki (aktywność powyżej 8 U/mg białka po 24-godzinnej inkubacji), natomiast aktywność gwałtownie obniżała się po przekroczeniu pH=9. W zakresie temperatur od 5°C do 40°C enzym doskonale zachował swoją aktywność (na poziomie powyżej 7,5 U/mg białka), a po przekroczeniu 40°C aktywność znacząco spadała i w temperaturze 60°C była znikoma. Wnioski Szczep B2 jest szczepem lipolitycznym o wysokiej aktywności zewnątrzkomórkowej. Najlepszymi źródłami węgla do hodowli szczepu B2 są oleje roślinne, a przede wszystkim oliwa z oliwek. Enzym wyizolowany z hodowli szczepu B2 nie jest wysoce termostabilny, gdyż jego aktywność spada po przekroczeniu 40°C, ale jest za to odporny na kwasowe środowisko, gdyż zachowuje swoją aktywność w pH w zakresie. od 2 do 9. Najlepszym substratem dla badanego enzymu okazał się być oktanian p-nitrofenolu. Dla tego substratu najkorzystniejszymi warunkami przeprowadzonej reakcji były temperatura 30°C i pH=6,2, aczkolwiek badania wykazały, że dla każdego substratu należy dobrać osobne parametry reakcji w celu uzyskania jak najlepszej wydajności reakcji.
File
Aleksandra Starzyk - praca magisterska.pdf 1.74 MB

Get link to the record
msginfo.png

Back