Characteristics of cis-prenylotransferaz Arabidopsis thaliana (AtCPT)

Artur Choroś

Abstract

-
Diploma typeMaster of Science
Author Artur Choroś
Artur Choroś,,
-
Title in PolishCharakterystyka cis-prenylotransferaz Arabidopsis thaliana (AtCPT)
Supervisor Patrycja Wińska ZTiBSL
Patrycja Wińska,,
- Department Of Drug Technology And Biotechnology
Certifying unitFaculty of Chemistry (FC)
Affiliation unitDepartment Of Drug Technology And Biotechnology (DDTB)
Study subject / specializationBiotechnologia Chemiczna - Leki i Kosmetyki
Languagepl polski
StatusFinished
Defense Date14-10-2013
Issue date (year)2013
Keywords in Polish-
Keywords in English-
Abstract in PolishAlkohole poliizoprenoidowe są szeroko rozpowszechnioną grupą związków w przyrodzie. Są to hydrofobowe związki, sklasyfikowane jako metabolity wtórne, których cząsteczki składają się z kilku do ponad 100 reszt izoprenowych. W zależności od obecności lub braku wiązania podwójnego w jednostce α-izoprenowej dzielimy je na poliprenole i dolichole. Proces biosyntezy poliizoprenoidów odbywa się w trzech etapach. W I etapie zachodzi biosynteza dwóch podstawowych jednostek budulcowych lipidów prenylowych - difosforanu izopentenylu (IPP) i difosforanu dimetyloallilu (DMAPP). W II etapie w wyniku kondesacji cząsteczek IPP i DMAPP formowany jest łańcuch poliizoprenoidowy. Kluczowymi enzymami zaangażowanymi w syntezę tych związków są cis-prenylotransferazy. W III etapie zachodzi konwersja difosforanów poliprenylu do poliprenoli i dolicholi. Alkohole poliizoprenoidowe mogą występować w formie wolnej, w postaci estrów kwasów karboksylowych oraz fosforanów. W zależności od tego w jakiej postaci występują w organizmie, pełnią różne funkcje. Fosforany dolicholi i poliprenoli są kofaktorami w procesach N- i O-glikozylacji białek, biorą udział w biosyntezie kotwicy fosfatydyloinozytolowej i bakteryjnego peptydoglikanu oraz są donorami grup izoprenoidowych w prenylacji białek. Genom rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana) zawiera rodzinę 9 genów kodujących cis-prenylotransferazy: AtCPT1 - AtCPT9 oraz LEW1. Do tej pory udało się scharakteryzować na poziomie molekularnym 3 geny: AtCPT1, AtCPT6 i LEW1. Celem niniejszej pracy jest charakterystyka jednej z dziewięciu cis-prenylotransferaz Arabidopsis thaliana – AtCPT9. W części doświadczalnej wklonowano cDNA kodujące AtCPT9 do wektorów bakteryjnych pENTR i pGEX-4T-1 oraz do wektora drożdżowego pYES-DEST. Po przeprowadzeniu analizy sekwencyjnej, a następnie porównaniu z sekwencjami zdeponowanymi w GenBank za pomocą programu ClustalW, wykazano 100% identyczności wklonowanej wstawki do sekwencji AtCPT9 (At5g58784). Nadprodukowano również białko AtCPT9-GST w E.coli BL21, którego tożsamość potwierdzono techniką spektometrii mas. Badanie funkcjonalnej komplementacji wzrostu mutanta rer2Δ z wstawką AtCPT9 w 37°C i przywracanie N-glikozylacji karboksypeptydazy Y pozwala stwierdzić, że cispreneylotransferaza 9 jest funkcjonalnym homologiem drożdżowej cis-prenylotransferazy Rer2 in vivo. Analiza HPLC poliizoprenoidów wykazała, że cis-prenylotransferaza 9 A.thaliana syntezuje krótkie, średnie jak i długie dolichole, zbudowane z 12 do 24 reszt izoprenowych w heterologicznym systemie drożdżowym.
File
Praca_magisterska_Artur_Choroś.pdf (file archived - login or check accessibility on faculty) Praca_magisterska_Artur_Choroś.pdf 793.39 KB


Back