Isolation and characteristic of psychrozymes obtain from antarctic bacterial strains

Kamila Anna Stąpor

Abstract

This thesis describes an isolation procedure of bacterial strains from Antarctic environmental samples of soil and fuel. 32 bacterial strains were isolated. Finally research was done on 101 strains including strains coming from Department of Technology and Biotechnology of Medicinal Products collection. Selection of microorganisms was based on a lipolytic activity on solid base containing a fluorescent dye – rhodamine B and also on Spirit Blue Agar base with pH indicator. Furthermore bases were enriched with emulsion of olive oil as lipolytic enzyme secretion inducer. Observations were carried out at five temperatures: 4, 10, 20, 30 i 37°C, which allowed to determine optimal temperature for further tests. Due to the fact that experiments conducted on solid bases did not show clearly which strain produces the highest amount of lipases, additional tests were conducted on liquid bases in two temperatures: 10 and 20°C. Quantitative measurement was done using spectrophotometric method based on enzyme analysis of the enzymatic hydrolysis of a p - nitrophenyl butyrate. This method allowed to extract the strain 11E8b (Psychrobacter sp.), which is characterized by the highest extracellular lipolytic activity. In the next step of this thesis the influence of type and concentration of the carbon and nitrogen source in the production medium on activity of strain 11E8b was examined. Series of tests were conducted on base NIC enriched with carbon sources such as: palmitic acid, stearic acid, glucose, tributyrin, Tween 20, Tween 80, starch, glycerol. Pure oil and emulsion of: sesame oil, rapeseed oil, grape oil, olive oil were also used. As the nitrogen sources, peptone from casein, soy and meat were tested. The impact on farming production of startup culture led in various forms was also determined. Enzyme substrate specificity for supernatant coming from established culture was specified. Its stability in different temperatures was also examined. Analysis of test results led to the conclusion that microorganism 11E8b (Psychrobacter sp.) is a lipolytic strain which is characterized by a high extracellular activity. Vegetable oils are the best inductors in particular olive oil (1% in base). Meat peptone (1,5%) should be used as carbon source in the culture of a strain. The optimal temperature of the culture of a strain stimulating its growth and lipolytic activity is 20°C. In addition, the curve of the activity of a strain is similar to the curve of growth. With the growth of the microorganism the value of the activity increases. Decrease in the number of microorganism in culture is associated with reduction of activity. Additionally it was found that startup bacterial culture has influence on lipolytic activity achieved in production culture. The best results were achieved after microorganism incubation for 72 hours in 20°C on startup base NIC enriched with 1% olive oil as emulsion. Then multiplied material was inoculated into production base NIC without glycerol containing 1,5% of meat peptone and enriched with 1% of pure olive oil. Incubation was conducted in 20°C. The highest value of activity was achieved after 96 hours of incubation and was 2,2 U/ml. Enzyme effectively utilizes long-chain pNP esters as the enzymatic reaction substrates. The pNP laurate (obtained activity: 12,5 U/ml) appeared to be the most preferred substrate. Obtained substrate specificity confirms assumption that obtained enzyme belongs to lipases. Temperature stability of enzyme was tested in reaction p-nitrophenyl with butyrate at temperature 4 to 60°C. The highest activity was obtained at 30°C. At the 60°C enzyme still showed 84% activity. Test results allow to state that the obtained protein is thermostable. Finally in the conducted research, the enzyme activity was increased 36 times in comparison with the initial activity.
Diploma typeMaster of Science
Author Kamila Anna Stąpor
Kamila Anna Stąpor,,
-
Title in PolishIzolacja i charakterystyka psychrozymów izolowanych z antarktycznych szczepów bakteryjnych
Supervisor Monika Wielechowska ZTiBSL
Monika Wielechowska,,
- Department Of Drug Technology And Biotechnology
Certifying unitFaculty of Chemistry (FC)
Affiliation unitDepartment Of Drug Technology And Biotechnology (DDTB)
Study subject / specializationBiotechnologia
Languagepl polski
StatusFinished
Defense Date14-10-2013
Issue date (year)2013
Keywords in Polish-
Keywords in English-
Abstract in PolishW pracy opisano procedurę izolacji psychrofilnych szczepów bakteryjnych z antarktycznych próbek środowiskowych gleby i paliwa. Wyizolowano samodzielnie 32 szczepy bakteryjne. Ostatecznie badania prowadzono łącznie na 101 szczepach włączając do analizy szczepy znajdujące się w kolekcji Zakładu Technologii i Biotechnologii Środków Leczniczych. Selekcja mikroorganizmów prowadzona była pod katem aktywności lipolitycznej na podłożach stałych zawierających fluorescencyjny barwnik – Rodaminę B oraz na podłożu Spirit Blue Agar ze wskaźnikiem pH. Dodatkowo podłoża wzbogacono w oliwę z oliwek w postaci emulsji jako induktor wydzielania enzymów lipolitycznych. Obserwacje prowadzono w pięciu temperaturach: 4, 10, 20, 30 i 37°C, co pozwoliło określić optymalną temperaturę do dalszych badań. Ze względu na fakt, iż doświadczenia prowadzone na podłożach stałych nie wskazały jednoznacznie, który ze szczepów charakteryzuje się najwyższą produkcją lipaz przeprowadzono dodatkowe badania w hodowli na podłożach płynnych w dwóch temperaturach: 10 lub 20°C. Pomiar ilościowy prowadzono metodą spektrofotometryczną opartą na analizie enzymatycznej hydrolizy maślanu p-nitrofenylu. Zastosowanie tej metody pozwoliło wyodrębnić szczep 11E8b (Psychrobacter sp.), charakteryzujący się największą zewnątrzkomórkową aktywnością lipolityczną. W kolejnym etapie pracy zbadano jaki wpływ na aktywność szczepu 11E8b ma rodzaj oraz stężenie źródła węgla i azotu w pożywce produkcyjnej. Przeprowadzono serię badań na podłożu NIC wzbogacanym w takie źródła węgla jak: kwas palmitynowy, kwas stearynowy, glukoza, tributyryna, Tween 20, Tween 80, skrobia, glicerol. Stosowano także oleje w postaci czystej i w emulsji: olej sezamowy, rzepakowy, z winogron, oliwę z oliwek. Jako źródła azotu badano pepton z kazeiny, z mięsa i z soi. Określono także jaki wpływ na hodowlę produkcyjną wywiera hodowla startowa prowadzona w różnych wariantach. W końcowej fazie badań dla supernatantu pochodzącego z ustalonej hodowli określono specyficzność substratową enzymu oraz zbadano jego stabilność w różnych temperaturach. Analiza uzyskanych wyników pozwoliła stwierdzić, iż mikroorganizm 11E8b (Psychrobacter sp.) jest szczepem lipolitycznym charakteryzującym się wysoką aktywnością zewnątrzkomórkową. Najlepszymi induktorami są oleje roślinne, a wśród nich oliwa z oliwek (1% w podłożu). Jako źródło węgla w hodowli szczepu należy stosować pepton z mięsa (1,5%). Optymalna temperatura hodowli szczepu, stymulująca 16 jego wzrost i aktywność lipolityczną wynosi 20°C. Dodatkowo przebieg krzywej aktywności szczepu jest analogiczny do przebiegu krzywej wzrostu – wraz ze wzrostem mikroorganizmu rośnie także wartość aktywności, a spadek liczby mikroorganizmów w hodowli wiąże się z obniżeniem aktywności. Dodatkowo stwierdzono, iż hodowla startowa wywiera wpływ na aktywność lipolityczną uzyskiwaną w odpowiedniej hodowli produkcyjnej. Najlepsze wyniki uzyskano po inkubacji mikroorganizmu przez 72 h w 20°C na podłożu startowym NIC wzbogaconym w 1% oliwy z oliwek w postaci emulsji. Następnie namnożony materiał zaszczepiono na podłoże produkcyjne NIC bez glicerolu zawierające 1,5% peptonu z mięsa i wzbogacone w 1% czystej oliwy z oliwek. Inkubację prowadzono w 20°C. Najwyższa wartość aktywności została uzyskana po 96 h inkubacji i wynosiła 2,2 U/ml. Ustalono także, że enzym efektywnie wykorzystuje długołańcuchowe estry pNP jako substraty do reakcji enzymatycznej. Najbardziej preferowanym substratem okazał się laurynian pNP (otrzymana aktywność wynosiła 12,5 U/ml). Uzyskana specyficzność substratowa pozwala potwierdzić założenie, że uzyskany enzym należy do lipaz. Badania stabilności temperaturowej enzymu w reakcji z maślanem p – nitrofenylu prowadzone były w zakresie temperatur od 4 do 60°C. Najwyższą aktywność uzyskano w temperaturze 30°C, zaś w temperaturze 60°C enzym nadal zachowywał 84% aktywności. Otrzymane wyniki pozwoliły stwierdzić, iż pozyskane białko jest termostabilne. Ostatecznie w serii prowadzonych badań aktywność enzymu zwiększono 36 razy w porównaniu do początkowej aktywności.
File
PRACA MAGISTERSKA Kamila Stąpor nr albumu 213748.pdf 4.85 MB

Get link to the record
msginfo.png

Back