A mathematical model of the kinetic resolution of mandelic acid enantiomers in a membrane reactor

Maciej Andrzej Sidorczuk

Abstract

Nowadays there are high requirements for drugs production. Medicines mustn’t contain chemical compounds which are health hazard. Moreover new techniques are constantly developed to decrease costs of drugs production. Especially single enantiomers of healing substance are very popular in the industrial pharmacy because of their different biological activity. The present study is concerned with mandelic acid derivatives. Pure mandelic acid enantiomers and its derivatives are widely used as chiral building blocks or as auxiliaries and resolving agents in pharmacy synthesis e.g. antibiotics and anti-tumour agents. The kinetic resolution is an interesting method which allows to obtain separated enantiomers. It bases on enantiospecificity of enzymes which catalyze enantiomers conversions to products with different rates. In specific conditions only one enantiomer reacts. It leads to a mixture of unreacted substrate enantiomer and an enantiomerically pure product. Both can be separated by physicochemical methods. The present study focused on the kinetic resolution of enantiomers of O-acetylmandelic acid by lipase catalyzed hydrolysis. Burhkolderia cepacia lipase was used as a catalyst. The resolution was carried out in a two-phase enzymatic membrane reactor with a flat sheet module containing a hydrophilic polyethersulfone membrane with an enzyme immobilized in its pores. Such reactors are very useful and have got many advantages e.g. they are cheap, they use less energy, they contain a huge specific area (inner and outer surface of the membrane), they can work in the continuous mode, they increase stability of enzymes and enable to reuse them in a future. Also reactors enable to carry out reaction and separate products from the reaction area simultaneously. It causes an advantageously equilibrium shift and decreases an effect of product inhibition. In the configuration which was described above two phases (organic and aqueous) were flowing in counter-current mode through the membrane module. An isopropyl ether with a dissolved racemate of O-acetylmandelic acid composed the organic phase while an ultrapure water composed the aqueous phase. Due to a diffusion phenomena the mixture of enantiomers penetrated into the membrane pores containing enzyme. Then the enzymatic hydrolysis occurred and (S)-O-acetylmandelic acid was converted to (S)-mandelic acid. (R)-mandelic acid seemed to not react at all. Mandelic acid is highly soluble in water due to its hydrophilic properties. Thus it passed through the hydrophilic membrane and entered the aqueous phase. This way led to separate products from the substrate. The purpose of the present study was to develop a mathematical model which describes the kinetic resolution process of O-acetylmandelic acid in the configuration which was presented above. The scope of the present study was a literature survey and laboratory investigations. The first step of laboratory investigations was the immobilization of enzymatic protein in membrane (MWCO 20kDa) pores. The biocatalyst was immobilized in membrane pores by cross-flow filtration of its solution through the membrane under 1 bar transmembrane pressure from the feed to the filtrate side. The used in experiments AMANO PS enzyme preparation also contains insoluble in water particles so it needs to be filtered. According to the experimental data the enzyme activity depends on a filter type. The best results were obtained when a cellulose filter was used. The amount of immobilized enzyme was calculated by using the mass balance and the experimental data (concentrations of protein in a filtrate, a concentrate and a flushing buffer solution which were determined by a Lowry’s method). Obtained results were repeatability. Based on pictures obtained from the scanning electron microscope (Phenom) membrane parameters such as thickness, porosity and size of the membrane pores were determined. These parameters were used to further calculations such as determination of diffusion coefficients and solution of equations based on mathematical model). The next step was the development of the kinetic model which describes the progress of hydrolysis of (S)-O-acetylmandelic acid catalyzed by the lipase from Burkholderia cepacia (immobilized in membrane pores) in the membrane reactor. In this case, the racemate of O-acetylmandelic acid dissolved in isopropyl ether (saturated by water) was passed through the membrane using two different values of pressure (1 bar and 2 bar) from the feed side. According to the obtained experimental data, investigated process ran in the kinetic regime. The enzymatic hydrolysis of (S)-O-acetylmandelic acid catalyzed by the used lipase in the two-phase enzymatic membrane reactor was described by the Bi Bi Ping Pong mechanism with a product inhibition. The presented hydrolysis proceed with a high enantioselectivity. Only enantiomer S was converted to the product. The enantiomeric excess of substrate increased with the substrate conversion and for α≈50% it reached approximately 100%. In this study, isopropyl ether-water partition coefficients for the substrate and products, mass transfer coefficients and the diffusion coefficient for the substrate were determined. Obtained partition coefficients showed that O-acetylmandelic acid is highly soluble in the isopropyl ether and slightly soluble in water. On the other hand mandelic acid and acetic acid are highly soluble in water and slightly soluble in the isopropyl ether. Mass transfer coefficients were determined using the experimental data (obtained in the two-phase enzymatic membrane reactor) and mathematical correlations which are available in the literature. All this parameters and coefficients were used to solve the model equations. Calculations provided a concentration profile of (S)-O-acetylmandelic acid in the membrane. It showed that the profile was linear which means that the process ran in the diffusion regime. Calculations provided also time dependence of (S)-O-acetylmandelic acid fluxes entering and leaving the membrane.
Diploma typeMaster of Science
Author Maciej Andrzej Sidorczuk
Maciej Andrzej Sidorczuk,,
-
Title in PolishMatematyczny model rozdziału kinetycznego enancjomerów kwasu migdałowego w reaktorze membranowym
Supervisor Katarzyna Dąbkowska ZBIB
Katarzyna Dąbkowska,,
- Department of Biotechnology and Bioprocess Engineering
Certifying unitFaculty of Chemistry (FC)
Affiliation unitDepartment of Biotechnology and Bioprocess Engineering (DBBE)
Study subject / specializationBiotechnologia Przemysłowa
Languagepl polski
StatusFinished
Defense Date07-01-2013
Issue date (year)2013
Keywords in Polish-
Keywords in English-
Abstract in PolishW dzisiejszych czasach nakłada się wysoki reżim czystości na środki farmaceutyczne. Wymagane jest, aby substancje lecznicze nie zawierały niepożądanych związków chemicznych, które mogłyby szkodzić ludzkiemu zdrowiu. Dodatkowo stale opracowuje się metody, które mogłyby zmniejszyć koszty produkcji farmaceutyków. Szczególnym zainteresowaniem przemysłu farmaceutycznego cieszą się pojedyncze enancjomery substancji o działaniu leczniczym. Wynika to z ich często różnej aktywności biologicznej. Niniejsza praca poświęcona jest kinetycznemu rozdziałowi enancjomerów pochodnej kwasu migdałowego. Czyste enancjomery kwasu migdałowego i jego pochodnych są szeroko stosowane jako chiralne bloki budulcowe lub czynniki pomocnicze w syntezie wielu farmaceutyków np. antybiotyków i leków przeciwnowotworowych. Kinetyczny rozdział jest jedną z metod pozwalającą na separację enancjomerów. W metodzie tej wykorzystuje się enancjospecyficzność enzymów, dzięki której enancjomery ulegają przemianie do produktu z różną szybkością. W odpowiednio dobranych warunkach prowadzenia procesu reaguje tylko jeden enancjomer z mieszaniny racemicznej substratu. Otrzymuje się wówczas równomolową mieszaninę nieprzereagowanego pojedynczego enancjomeru substratu oraz czystego enancjomerycznie produktu, które można od siebie oddzielić na drodze tradycyjnych metod fizykochemicznych. W ramach niniejszej pracy kinetyczny rozdział enancjomerów kwasu O-acetylomigdałowego prowadzono na drodze hydrolizy katalizowanej lipazą z Burkholderia cepacia. Proces prowadzono w dwufazowym enzymatycznym reaktorze membranowym z płaskim modułem zawierającym hydrofilową membranę polieterosulfonową, w porach której unieruchomiono enzym. Zastosowanie reaktorów membranowych przynosi szereg korzyści m.in. są one tanie, zużywają mało energii, posiadają dużą powierzchnię właściwą (wewnętrzna i zewnętrzna powierzchnia membrany) a także umożliwiają prowadzenie procesów w sposób ciągły oraz jednocześnie prowadzenie reakcji oraz separacji produktów z przestrzeni reakcyjnej co wpływa korzystnie na przesunięcie równowagi i zmniejsza wpływ inhibicji enzymu produktem. Dodatkowo, dzięki unieruchomieniu biokatalizatorów w membranie zwiększona jest ich stabilność i możliwe wielokrotne użycie. W badanym układzie przez moduł membranowy przepływały względem siebie przeciwprądowo dwie fazy – faza organiczna oraz faza wodna. Fazę organiczną stanowił eter izopropylowy, w którym rozpuszczono mieszaninę racemiczną kwasu O-acetylomigdałowego. Fazę wodną stanowiła ultraczysta woda. Mieszanina enancjomerów na skutek dyfuzji wnikała w głąb porów membrany i docierała do unieruchomionego enzymu. Wówczas zachodziła enzymatyczna hydroliza kwasu (S)-O-acetylomigdałowego (kwas (R)-O-acetylomigdałowy nie ulegał reakcji) i powstawał kwas (S)-migdałowy, który bardzo dobrze rozpuszcza się w wodzie. Z tego też względu z łatwością przechodził on przez hydrofilową membranę i wnikał do fazy wodnej. W ten sposób uzyskano oddzielenie produktu od nieprzereagowanego enancjomeru substratu. Celem niniejszej pracy było opracowanie modelu matematycznego opisującego proces kinetycznego rozdziału enancjomerów kwasu O-acetylomigdałowego w stosowanym dwufazowym enzymatycznym reaktorze membranowym. Zakres pracy obejmował przegląd literatury dotyczącej tematyki pracy oraz badania doświadczalne. Pierwszy etap pracy doświadczalnej obejmował immobilizację białka enzymatycznego w porach membrany polieterosulfonowej o punkcie odcięcia wynoszącym 20kDa. Prowadzono ją na drodze filtracji krzyżowej wodnego roztworu preparatu AMANO PS, zawierającego lipazę z Burkholderia cepacia, przez membranę przy ciśnieniu po stronie nadawy wynoszącym 1 bar. Stosowany preparat enzymatyczny oprócz białka zawierał także związki nierozpuszczalne w wodzie. Z tego względu potrzebne było ich oddzielenie z roztworu, czego dokonano filtrując roztwór przed immobilizacją na różnych filtrach. Stwierdzono, że aktywność enzymu unieruchomionego w membranie zależy od filtra stosowanego przed immobilizacją. Najlepsze wyniki uzyskano w przypadku zastosowania filtra celulozowego. Ilość unieruchomionego enzymu w porach membrany wyznaczono z bilansu masowego na podstawie oznaczonych metodą Lowry’ego stężeń białka w permeacie i retentacie uzyskanych w trakcie immobilizacji oraz w buforze użytym do płukania membrany po immobilizacji. Uzyskano dobrą powtarzalność ilości unieruchomionego białka w membranie. Na podstawie zdjęć wykonanych z użyciem skaningowego mikroskopu elektronowego Phenom firmy FEI w ramach pracy wyznaczono parametry charakteryzujące stosowaną membranę polieterosulfonową (grubość, porowatość oraz średnia wielkość porów). Parametry te zostały wykorzystane w dalszej części do wyznaczenia współczynników dyfuzji w porach membrany z unieruchomionym enzymem oraz rozwiązania równań stanowiących model matematyczny. Kolejnym punktem badań było opracowanie modelu kinetycznego opisującego przebieg badanej reakcji w reaktorze z unieruchomionym w porach membrany enzymem. W tym celu roztwór kwasu O-acetylomigdałowego w eterze izopropylowym nasyconym wodą przepuszczano przez membranę z użyciem dwóch różnych wartości ciśnienia panującego po stronie nadawy, które wynosiło 1 bar lub 2 bary. Na podstawie otrzymanych wyników stwierdzono, że proces hydrolizy przebiega w reżimie kinetycznym. Przebieg reakcji opisano modelem Bi Bi Ping Pong z inhibicją mieszaną produktem. Hydroliza kwasu O-acetylomigdałowego w omawianym układzie przebiega z wysoką enancjoselektywnością i przemianie do produktu ulega praktycznie tylko enancjomer S substratu. Nadmiar enancjomeryczny substratu rośnie wraz ze wzrostem stopnia przemiany i dla α≈50% wynosi on ok. 100%. W pracy wyznaczono także współczynniki podziału substratów i produktów reakcji między eter izopropylowy a wodę, oraz współczynniki dyfuzji, wnikania i przenikania masy składników mieszaniny reakcyjnej. Z uzyskanych wartości współczynników podziału wynika, że kwas O-acetylomigdałowy dobrze rozpuszcza się w eterze izopropylowym, a bardzo słabo w wodzie, z kolei kwas migdałowy i kwas octowy rozpuszcza się znacznie lepiej w wodzie niż w eterze. Do wyznaczenia współczynników wnikania masy w badanym układzie wykorzystano dane doświadczalne uzyskane w wyniku reakcji prowadzonych w układzie dwufazowym oraz dostępne w literaturze korelacje matematyczne. Otrzymane wartości wyznaczonych parametrów i współczynników wykorzystano następnie do rozwiązania równań stanowiących model matematyczny badanego procesu. Na jego podstawie uzyskano liniowy profil stężenia substratu w membranie, który świadczy o tym, iż reakcja przebiega w reżimie dyfuzyjnym. Uzyskano również zależności gęstości strumienia molowego substratu na wejściu i wyjściu z membrany od czasu, które tłumaczą zmiany stężenia kwasu (S)-O-acetylomigdałowego w fazie wodnej.
File
Praca Magisterska Maciej Sidorczuk.docx (file archived - login or check accessibility on faculty) Praca Magisterska Maciej Sidorczuk.docx 3.71 MB


Back