Knowledge base: Warsaw University of Technology

Settings and your account

Back

Preparation of quantum dots conjugates with redox-active proteins

Krzysztof Jakub Szczepaniak

Abstract

Introduction Since their discovery in the mid 80’s of the last century, luminescent nanocrystals are of great interest of scientists. These structures, later named quantum dots (QD), have a potential to revolutionize cellular imagining. Such colloidal nanocrystals are also useful in variety of other fields due to their unique features. One of the most important characteristics of QDs is a correlation between maximum wavelength of their emission and their diameter. What is more, the nanocrystals have wide Stockes shift, what means that, unlike emission, extinction maximum in not dependent on the nanocrystal size. The conjugation of the quantum dots with enzymes, especially with redox-active proteins, is not yet widely studied. It is known that QDs may accept or donate electrons, therefore they may became a donor or acceptor in redox reactions. What is more, increased concentration of free electrons occurs in a close vicinity of nanocrystals surface. For that reason redox-active proteins attached to the surface of the quantum dots may possibly modify emission characteristics of those fluorophores. The purpose of presented work was to obtain stable conjugate of QDs and photosynthetic proteins- ferredoxin:NADP+ oxidoreductase (FNR) and ferredoxin (Fd), with a special attention put on preserving the native activity of both proteins. The process and final product of conjugate formation was characterized with spectroscopic methods. Results and discussion Hydrophilic quantum dots with strong emission and only slight maximum shift were obtained as a result of first phase of experiments. Such nanocrystals dissolved in water were stable over long period of time in neutral and basic pH. Several conjugation methods were tested, and two of them, using popular cross-linker 1-ethyl-3-(3-dimethylaminoprophyl)carbodiimide (EDC), with or without addition of N-hydroxysuccinimide gave the best results. Stable conjugates with bovine serum albumin were obtained, confirmed with fluorescence spectroscopy. The method using only EDC was found to be more effective. Both methods were further tested for FNR and Fd conjugation. Obtaining of both protein conjugates were confirmed by spectroscopic and fluorimetric techniques. Method using only EDC was again found to be more effective. Unfortunately, during conjugation procedure the active center of ferredoxin was destroyed. Taking into account all results, a method using only EDC was chosen as the best for following work. It was further found that in QD-FNR structures the protein was enzymatically active, which was confirmed by in vitro NADPH oxidation reaction . The kinetic data proved that at least 50% of the enzyme native activity was preserved. In vitro reconstruction of an active center of ferredoxin was tested, although without satisfying results. All experiments confirmed effectiveness of conjugation methods described in scientific literature and alloved to select the best conjugation technique for proteins of interest. Stable QD-FNR conjugates were obtained, with the protein retaining over 50% of its native activity.
Record ID
WUT9a84ba54b70a4aa590fd0ced8bda84d4
Diploma type
Master of Science
Author
Krzysztof Jakub Szczepaniak Krzysztof Jakub Szczepaniak,, Undefined Affiliation
Title in Polish
Utworzenie i charakterystyka in vitro i in vivo konjugatu kropki kwantowej CdSe/ZnS z wybranymi białkami modelowymi
Supervisor
Antoni Pietrzykowski (FC/DCOC) Antoni Pietrzykowski,, Department Of Catalysis And Organometallic Chemistry (FC/DCOC)Faculty of Chemistry (FC)
Certifying unit
Faculty of Chemistry (FC)
Affiliation unit
Department Of Catalysis And Organometallic Chemistry (FC/DCOC)
Study subject / specialization
, Mikrobioanalityka
Language
(pl) Polish
Status
Finished
Defense Date
29-08-2012
Issue date (year)
2012
Keywords in Polish
-
Keywords in English
-
Abstract in Polish
Wprowadzenie Od momentu swojego odkrycia w połowie lat osiemdziesiątych ubiegłego wieku nanokryształy o właściwościach luminescencyjnych są obiektem szczególnego zainteresowania naukowców. Struktury takie, nazwane później kropkami kwantowymi (quantum dots – QD) mają szansę spowodować rewolucję m.in. w obrazowaniu komórkowym. Koloidalne nanokryształy posiadają cechy przydatne również w innych gałęziach nauki, jak chociażby w fizyce kwantowej i przy konstrukcji komputerów kwantowych. Pierwsza z ich ważnych właściwości to zależność pomiędzy długością maksimum emisji a rozmiarem nanokryształu. Druga istotna cecha to znaczne przesunięcie stokesowskie. Oznacza to, że maksimum wzbudzenia kropki kwantowej, w przeciwieństwie do maksimum emisji, nie zależy od jej rozmiaru. Znacznie mniej eksploatowanym zagadnieniem jest funkcjonalizowanie kropek kwantowych białkami enzymatycznymi, a w szczególności oddziaływanie QD z białkami aktywnymi w reakcjach redoks. Wiadomo jednak, że QD są w stanie przyjmować lub oddawać elektrony, a więc mogą funkcjonować jako donor lub akceptor w reakcji redoks. Co więcej, wokół wzbudzonych kropek kwantowych występuje zwiększone stężenie wolnych elektronów o dużej energii, dlatego też, białka redoks-aktywne przyłączone do powierzchni nanokryształu mogą potencjalnie modyfikować jego właściwości emisyjne. Celem pracy było uzyskanie stabilnego koniugatu kropek kwantowych z białkami fotosyntetycznymi: oksydoreduktazą ferredoksyna:NADP+(FNR) oraz ferredoksyną (Fd), ze szczególnym naciskiem na zachowanie aktywności obu białek oraz scharakteryzowanie procesu tworzenia koniugatów przy użyciu technik spektroskopowych. Wyniki i dyskusja W wyniku przeprowadzonych doświadczeń otrzymano hydrofilowe kropki kwantowe CdSe/ZnS wykazujące silną emisję oraz jedynie niewielkie przesunięcia jej maksimum. Nanokryształy rozpuszczone w wodzie były stabilne przez długi okres czasu w pH neutralnym i zasadowym. Dwie metody koniugacji wykorzystujące popularny odczynnik sieciujący 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimid (EDC), w jednym z wariantów reagujący w obecności N-hydroksysukcynimid (NHS) dały zadowalające rezultaty. Uzyskano stabilne koniugaty QD z albuminą surowicy wołu (BSA), co potwierdzono przy użyciu spektroskopii fluorescencyjnej. Metoda wykorzystująca reakcję z samym EDC wykazała większą skuteczność. Obie metody dające pozytywne rezultaty zostały przetestowane w koniugacji z białkami redoks aktywnymi: FNR i Fd. Badania spektroskopowe i fluorymetryczne pozwoliły potwierdzić uzyskanie koniugatów obu białek z QD. Po raz kolejny stwierdzono wyższą wydajność reakcji w obecności jedynie EDC. Niestety w trakcie reakcji dochodziło do zniszczenia centrum żelazo-siarkowego ferredoksyny. Stwierdzono, że najlepszą metodą koniugacji wybranych białek jest technika z wykorzystaniem EDC. W przypadku układu QD-FNR przyłączone białko było funkcjonalne, co potwierdzono poprzez przeprowadzenie in vitro reakcji utleniania NADPH. Eksperyment i przybliżone obliczenia wykazały, że białko zachowało ponad 50% swojej aktywności. Podjęto również próbę odtworzenia centrum żelazo-siarkowego ferredoksyny. Przeprowadzona reakcja nie przyniosła jednak oczekiwanych rezultatów: centrum Fe2S2 nie zostało odtworzone. W wyniku doświadczeń potwierdzono skuteczność opisanych w literaturze metod solubilizacji kropek kwantowych, oraz wyselekcjonowano najlepszą dla badanych białek metodę koniugacji z kropkami kwantowymi. Uzyskano stabilny koniugat QD z oksydoreduktazą ferredoksyna:NADP+, przy zachowaniu ponad 50% aktywności białka natywnego.
File
  • File: 1
    Praca magisterska - Krzysztof Szczepaniak.pdf
Request a WCAG compliant version

Uniform Resource Identifier
https://repo.pw.edu.pl/info/master/WUT9a84ba54b70a4aa590fd0ced8bda84d4/
URN
urn:pw-repo:WUT9a84ba54b70a4aa590fd0ced8bda84d4

Confirmation
Are you sure?
Report incorrect data on this page