Knowledge base: Warsaw University of Technology

Settings and your account

Back

ANALYSIS OF CYSTEINE REDOX MODIFICATIONS IN SYNAPTOSOMAL PROTEINS USING MASS SPECTROMETRY

Monika Justyna Puchalska

Abstract

The purpose of this study was to develop methods based on mass spectrometry for the identification of S-glutathionylated proteins in complex protein samples and apply them to analyze proteins in synaptosomal fractions obtained from a mouse model of Alzheimer’s disease and a control organism. Alzheimer’s disease (AD) is a neurodegenerative disorder characterized by disturbed cell redox homeostasis. As a consequence, changes in the level and type of protein redox modifications are suggested. One of them - S-glutathionylation, plays an important role in redox signaling and the regulation of protein activity. It is believed that during oxidative stress S-glutathionylation protects proteins against irreversible oxidative damage. Identification of S-glutathionylated proteins was carried out using liquid chromatography-coupled tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). This method was successful in the identification of S-glutathionylated proteins in samples with a high level of exogenous glutathionylation. However, only enrichment of S-glutathionylated proteins or their tryptic peptides allowed the identification of the endogenous modification. Several enrichment methods were used including immunoprecipitation with a glutathione recognizing antibody, affinity chromatography on immobilized glutathione S-transferase resin and an indirect Biotin Switch method (BSM). The result of these studies is the identification of eight endogenously S-glutathionylated proteins in synaptosomes obtained from a mouse model of AD: probable ATP-dependent RNA helicase DHX40, mitochondrial malate dehydrogenase, cytoplasmic malate dehydrogenase, CUB domain-containing protein 1, myelin proteolipid protein, amyloid beta A4 precursor protein-binding family B member 3, mCG141872, isoform CRA c and Enpp7 protein. The first three were found to be S-glutathionylated in both the AD model and control organisms while the next five identified proteins are modified solely in AD. Some of identified proteins have been previously suggested in literature as important factors in the development of AD.
Record ID
WUT9a1772b7c3eb461db73776cdf666e6bf
Diploma type
Master of Science
Author
Monika Justyna Puchalska Monika Justyna Puchalska,, Undefined Affiliation
Title in Polish
ZASTOSOWANIE SPEKTROMETRII MAS W ANALIZIE REDOKSOWYCH MODYFIKACJI CYSTEIN W BIAŁKACH SYNAPTOSOMALNYCH
Supervisor
Katarzyna Pawlak (FC/CAC) Katarzyna Pawlak,, Chair Of Analytical Chemistry (FC/CAC)Faculty of Chemistry (FC)
Certifying unit
Faculty of Chemistry (FC)
Affiliation unit
Chair Of Analytical Chemistry (FC/CAC)
Study subject / specialization
, Mikrobioanalityka
Language
(pl) Polish
Status
Finished
Defense Date
25-09-2012
Issue date (year)
2012
Keywords in Polish
-
Keywords in English
-
Abstract in Polish
Celem niniejszej pracy było opracowanie opartych na spektrometrii mas metod identyfikacji S-glutationylowanych białek w próbkach złożonych i zastosowanie ich do analiz białek synaptosomalnych pochodzących z mysiego modelu choroby Alzheimera oraz szczepu kontrolnego. Choroba Alzheimera (z ang. Alzheimer disease, AD) jest neurozwyrodnieniowym schorzeniem charakteryzującym się zaburzeniem komórkowej homeostazy redoks. W konsekwencji tego zaburzenia może dochodzić do zmian w poziomie i rodzaju redoksowych modyfikacji białek. Jedna z tych modyfikacji - S-glutationylacja pełni ważną rolę w regulacji ich aktywności i w przekazywaniu sygnałów. Modyfikacji tej przypisywana jest funkcja ochrony białek przed ich nieodwracalnymi uszkodzeniami podczas stresu oksydacyjnego. Identyfikację S-glutationylowanych białek prowadzono za pomocą tandemowej spektrometrii mas sprzężonej z chromatografią cieczową (LC-MS/MS). Metoda ta z powodzeniem pozwoliła zidentyfikować miejsca S-glutationylacji w białkach o wysokim poziomie egzogennie wprowadzonej modyfikacji. Jednakże do identyfikacji endogennych miejsc glutationylacji niezbędny okazał się etap wzbogacania próbki w S-glutationylowane białka lub po ich trawieniu – w S-glutationylowane peptydy. W tym celu zastosowano kilka metod wzbogacania: immunoprecypitację z przeciwciałem rozpoznającym glutation, chromatografię powinowactwa na złożu z immobilizowaną transferazą glutationu i pośrednią metodę Biotin Switch (BSM). Wynikiem przeprowadzonych badań była identyfikacja ośmiu S-glutationylowanych białek w synaptosomach wyizolowanych z mysiego modelu choroby Alzheimera: helikazy zależnej od ATP, mitochondrialnej dehydrogenazy jabłczanowej, cytozolowej dehydrogenazy jabłczanowej, białka zawierającego domenę CUB 1, mielinowego białka proteolipidowego, białka wiążącego APP z rodziny B,3, mCG141872 (izoforma CRA c) i białka Enpp7. Pierwsze trzy białka zostały zidentyfikowane w organizmie modelowym AD i w organizmie kontrolnym, natomiast następne pięć zostało zidentyfikowane jedynie w modelu AD. Niektóre ze zidentyfikowanych białek były wskazane w literaturze jako ważne czynniki w rozwoju choroby Alzheimera.
File
  • File: 1
    PRACA MAGISTERSKA.pdf
Request a WCAG compliant version

Uniform Resource Identifier
https://repo.pw.edu.pl/info/master/WUT9a1772b7c3eb461db73776cdf666e6bf/
URN
urn:pw-repo:WUT9a1772b7c3eb461db73776cdf666e6bf

Confirmation
Are you sure?
Report incorrect data on this page