Knowledge base: Warsaw University of Technology

Settings and your account

Back

Badanie oddziaływań leków cytostatycznych z białkami za pomocą CE

Agata Siwek

Abstract

-
Record ID
WUT7c48074073524c15a110640fd26780f3
Diploma type
Master of Science
Author
Agata Siwek Agata Siwek,, Undefined Affiliation
Supervisor
Katarzyna Pawlak (FC/CAC) Katarzyna Pawlak,, Chair Of Analytical Chemistry (FC/CAC)Faculty of Chemistry (FC)
Certifying unit
Faculty of Chemistry (FC)
Affiliation unit
Chair Of Analytical Chemistry (FC/CAC)
Study subject / specialization
, Mikrobioanalityka
Language
(pl) Polish
Status
Finished
Defense Date
12-01-2012
Issue date (year)
2012
Keywords in Polish
-
Keywords in English
-
Abstract in Polish
Wstęp Nowotwory są grupą chorób, w których zmienione poprzez mutacje komórki dzielą się w niekontrolowany przez organizm sposób unikając jednocześnie apoptozy i łatwo rozprzestrzeniają się w organizmie tworząc w ten sposób przerzuty i niszcząc zdrowe tkanki. Komórki nowotworowe różnią się od zdrowych zarówno morfologią jak i pod względem biochemicznym i genetycznym. Wybór metody leczenia zależy od rodzaju, lokalizacji guza, stopnia zaawansowania choroby i ogólnego stanu pacjenta. Rak może być leczony chirurgicznie, za pomocą radioterapii, immunoterapii, przeciwciałami monoklonalnymi bądź poprzez chemioterapię. Chemioterapia wykorzystuje substancje chemiczne o działaniu cytostatycznym. Leki dobiera się tak, aby zabijały komórkę w odmienny sposób, w różnych fazach cyklu komórkowego i jednocześnie miały różne działania niepożądane w celu uniknięcia nasilenia się tych samych efektów ubocznych. Ogólnie, cytostatyki zaburzają cykl komórkowy hamując tym samym rozwój komórek i doprowadzając wszystkie szybko rozwijające się komórki ciała do apoptozy. Stosowana od lat 70-tych cisplatyna jest najbardziej rozpowszechnionym cytostatykiem, jednak wykazuje się ograniczoną aktywnością przeciwnowotworową spowodowaną zjawiskiem wrodzonej lub nabytej lekoodporności, a także wieloma działaniami niepożądanymi. Kompleks KP1019 ([trans-tetrachlorobis(1H-indazolo)] rutenian(III) indazolu) został opracowany jako selektywnie działający analog cisplatyny o najwyższej cytotoksyczności pośród badanych leków rutenowych obniżający prawdopodobieństwo reemisji nowotworu. Do badań oddziaływań lek-białko stosowana jest wysokorozdzielcza elektroforeza kapilarna (CE) wraz z wysokoczułym spektrometrem mas z jonizacją w plazmie indukcyjnie sprzężonej (ICP MS). Dotychczasowo wykazano, że ok. 98% podawanego do krwi KP1019 wiąże się z albuminą, jednak kluczowe znaczenie w transporcie kompleksu rutenu do komórki rakowej ma transferyna. Uważa się, że zwiększony w komórkach nowotworowych poziom glutationu, kwasu askorbinowego i cytrynowego indukuje redukcję obojętnego biologicznie Ru(III) do Ru(II) i rozpad adduktu. Proces ten jest niezbędny do aktywacji leku i dalszego działania przeciwnowotworowego. Celem pracy było zbadanie wpływu środowiska cytozolu na trwałość adduktów tworzonych przez białka transportujące z rutenowym cytostatykiem KP1019. Wyniki i dyskusja Elektroforeza kapilarna jako technika analityczna ma coraz większe zastosowanie w badaniach leków o zastosowaniu terapeutycznym. Dzięki niej możemy badać stabilność leku, mechanizm degradacji (hydrolizę), powinowactwo do istotnych biocząsteczek (DNA, aminokwasów, białek itd.), zachowanie w obecności związków redukujących/utleniających, lub określić mechanizm kinetyki i termodynamiki reakcji biotransformacji. Zaletą elektroforezy kapilarnej jest mała objętość próbki (do 40 nl), co umożliwia liczne powtórzenia analiz przy minimalnym zużyciu kosztownych odczynników. Wadą tej techniki jest mała czułość, co może być rozwiązane poprzez połączenie z czułym detektorem. Spektrometr mas z plazmą indukcyjnie sprzężoną (ICP MS) jest jedną z najczulszych technik analitycznych umożliwiającą szybką analizę wielopierwiastkową na poziomie śladów (ng l-1) z rozróżnieniem poszczególnych izotopów. Dobrą czułość technika ta zawdzięcza prawie całkowitej jonizacji większości pierwiastków w wysokiej temperaturze plazmy. Badania były prowadzone przy użyciu białek transportujących krwi - albuminy, apo-transferyny i holo-transferyny (transferyny zawierającej jon Fe(III)). Założono, że addukt lek-białko powinien być tworzony w warunkach odpowiadających składowi krwi, natomiast elektrolit pracujący wypełniający kapilarę powinien odzwierciedlać środowisko cytozolu komórki rakowej. Stwierdzono, że każde z badanych białek jest w stanie przyłączyć 2 cząsteczki KP1019. Śledzenie sygnału pochodzącego od izotopu żelaza 57 występującego w holotransferynie pozwoliło potwierdzić komigrację białka z kompleksem rutenu, a tym samym obecność adduktu. Obecność żelaza potwierdza także proponowane przez inne zespoły współwystępowanie żelaza i KP1019 w addukcie i ważną rolę indazolu w tworzeniu adduktu wykluczając w ten sposób prostą wymianę jonu Fe(III) przez kompleks rutenu(III). Proces rozdzielania elektroforetycznego był prowadzony w warunkach obniżonego pH (6,0 – analogicznego do cytozolu komórki rakowej), który mógł prowadzić do częściowej dysocjacji tworzonego adduktu. Wpływ ten wykluczono poprzez coraz dłuższe utrzymywanie adduktu w buforze roboczym CE. Ze względu na fakt, że rozpad adduktu jest konieczny w celu umożliwienia oddziaływania kompleksu metalu z DNA zbadany został wpływ składników cytozolu, które mogą być odpowiedzialne za redukcję Ru(III) do Ru(II) i tym samym prowadzić do zmniejszenia powinowactwa kompleksu metalu do białka. Z badanych związków (kwas askorbinowy, cytrynowy i glutation), stwierdzono, że zwiększone stężenie glutationu w cytozolu komórki rakowej ma istotne znaczenie i prowadzi do rozpadu adduktów KP1019 z transferyną. W przypadku albuminy, żaden z czynników nie prowadził do dysocjacji adduktu potwierdzając jego trwałość i inny charakter działania. Wnioski Połączenie elektroforezy kapilarnej ze spektrometrem mas z jonizacją w plazmie indukcyjnie sprzężonej pozwala na śledzenie procesu tworzenia i dysocjacji adduktu białka transportującego z kompleksem KP1019 ([trans-tetrachlorobis(1H-indazolo)] rutenianem(III) indazolu). Możliwość jednoczesnej obserwacji wielu pierwiastków pozwala potwierdzić równoczesne istnienie wiązania pomiędzy białkiem a jonem żelaza i kompleksem rutenu i jego rozpad. Otrzymane wyniki pozwoliły stwierdzić, że największy udział w procesie rozpadu adduktu transferyna-KP1019 i transferyna-Fe-KP1019 ma glutation i że obecność tych związków w cytozolu (pH 6,0) nie wpływa na trwałość adduktów utworzonych przez albuminę.
File
  • File: 1
    agata siwek 206413.pdf
Request a WCAG compliant version

Uniform Resource Identifier
https://repo.pw.edu.pl/info/master/WUT7c48074073524c15a110640fd26780f3/
URN
urn:pw-repo:WUT7c48074073524c15a110640fd26780f3

Confirmation
Are you sure?
Report incorrect data on this page