-

Rafał Jan Bazan

Abstract

-
Diploma typeMaster of Science
Author Rafał Jan Bazan
Rafał Jan Bazan,,
-
Title in PolishIdentyfikacja partnerów drożdżowego białka Rbs1 przy użyciu spektrometrii mas
Supervisor Magdalena Rakowska-Boguta ZTiBSL
Magdalena Rakowska-Boguta,,
- Department Of Drug Technology And Biotechnology
Certifying unitFaculty of Chemistry (FC)
Affiliation unitDepartment Of Drug Technology And Biotechnology (DDTB)
Study subject / specializationMikrobioanalityka
Languagepl polski
StatusFinished
Defense Date11-09-2013
Issue date (year)2013
Keywords in Polish-
Keywords in English-
Abstract in PolishBiałko Rbs1 ciągle pozostaje białkiem o nieznanej funkcji. Istnieją jednak przesłanki, iż Rbs1 może odgrywać ważną rolę w powstawaniu tRNA poprzez transport polimerazy III z cytoplazmy do jądra komórkowego, aby umożliwić poprawne przeprowadzenie procesu transkrypcji. Proces transkrypcji zachodzi w wszystkich żywych komórkach eukariotycznych z udziałem trzech polimeraz RNA: Pol I, Pol II i Pol III. Mechanizm importu jądrowego tych kompleksów został dobrze poznany w przypadku polimerazy II, dla której wykazano składanie na terenie cytoplazmy i import gotowego enzymu do jądra komórkowego. W przypadku polimerazy III mechanizm ten nie jest ciągle do końca poznany, a punktem wyjścia do przeprowadzenia badań jest supresja przez gen RBS1 mutacji rpc128-1007 znajdującej się w białku C128 – drugiej co do wielkości podjednostki polimerazy III, która to mutacja powoduje obniżenie poziomu tRNA, co można pośrednio przełożyć na zaburzenie transportu polimerazy III do jądra. Celem pracy dyplomowej była analiza partnerów drożdżowego białka RBS1, ze szczególnym uwzględnieniem białek należących do polimeraz przy użyciu metody chromatografii powinowactwa połączonej z spektrometrią mas, a następnie potwierdzenie tych oddziaływań przy użyciu metody ko-immunoprecypitacji. Przygotowano zatem szczepy drożdżowe zawierające w swoim genomie geny kodujące białko fuzyjne RBS1 ze znacznikiem GFP oraz TAP, aby następnie po hodowli i ekstrakcji białek poddać je działaniu złoża z zaimmobilizowanym odpowiednim przeciwciałem. Uzyskane eluaty poddano analizie spektrometrią mas, i w obu przypadkach wykryto 6 białek należących do polimeraz. Szczególną uwagę zwrócono na podjednostki AC19 i AC40 wchodzące w skład polimerazy III. W celu potwierdzenia oddziaływania pomiędzy białkiem RBS1 a AC19 wykonano ko-immunoprecypitację używając ekstraktów z szczepów zawierających w swoim genomie geny kodujące białka fuzyjne: RBS1 ze znacznikiem MYC oraz AC19 ze znacznikiem HA. Uzyskane wyniki pozwoliły stwierdzić, iż istnieje oddziaływanie pomiędzy zaimmobilizowanym białkiem AC19 a RBS1, jednak nie można było potwierdzić tego oddziaływania immobilizując białko RBS1. Dodatkowo zdecydowano się na użycie czynnika sieciującego białka, aby podnieść wydajność ko-immunoprecypitacji, jednak wyniki okazały się niezadowalające, gdyż nie uzyskano lepszej wydajności, a oddziaływanie pomiędzy AC19 a RBS1 potwierdzono tylko w przypadku zastosowania czynnika sieciującego na ekstrakt białkowy.
File
Praca_Magisterska_Bazan_Rafal.pdf 2.06 MB

Get link to the record
msginfo.png

Back