Optimisation of chemical cell disruption for automated application

Wojciech Stepień

Abstract

Escherichia coli cells are commonly used for recombinant protein production. These proteins and enzymes have wide range of applications in medicine, food, pharmaceutical and biotechnological industry. From a commercial point of view of the process, protein recovery from the cells is the most crucial step. If protein recovery is not efficient, lots of product and money is wasted. Efficient disruption of cell is the first step of isolation of intracellular products from any kind of cells. This can be obtained by various disruption methods, including mechanical, physical, chemical and enzymatic treatment of cells after culture. High-throughput screening is a novel, very beneficial approach in scientific protein studies, which can be also useful in process development. It allows running many parallel small-scale experiments, making the whole procedure faster and more cost-effective. For protein studies, recombinant protein has to be released from cells in sufficient amount. Therefore, efficient cell disruption procedure is needed. The goal of the thesis was to find a procedure for automated cell disruption, which can be used in high-throughput screening. Focusing on chemical and enzymatic treatment, aim was to obtain optimal composition of lysis buffer for disruption of E.coli cells. Components commonly used for cell disruption i.e. EDTA, polymyxin B, guanidine-HCl, Tween 20 and lysozyme, were studied. Design of Experiment (DOE) approach was used to generate the plan of series of experiments. Using automatic pippeting robot numerous lysis buffers, containing various ratios of disrupting agents, were prepared on 96-well plate. These buffers were used for cell disruption. To evaluate disruption efficiency, analysis of the quantity and the activity of released model protein (β- galactosidase) was performed. Using results of this analysis, mathematical model was created, which was then used to find optimal buffer composition. Efficiency of obtained buffer was compared with BugBuster® – the commercially available lysis buffer and mechanical methods used in process scale i.e. sonication and glass bead milling. The results obtained during these studies show, that chemical disruption is very efficient method of cell disruption. Lysis induced by BugBuster® allowed releasing more protein than both mechanical methods. What is more, released protein had higher activity. Further studies allowed obtaining buffer composition, which gave even better results. Buffer containing lysozyme, EDTA, Tween 20 and polymyxin B allowed releasing up to 200 % more intracellular protein with up to 50 % higher activity than results achieved with BugBuster® treatment.
Diploma typeMaster of Science
Author Wojciech Stepień
Wojciech Stepień,,
-
Title in PolishDobór warunków zautomatyzowanego procesu dezintegracji komórek metodami chemicznymi
Supervisor Maciej Pilarek ZBIB
Maciej Pilarek,,
- Department of Biotechnology and Bioprocess Engineering
Certifying unitFaculty of Chemistry (FC)
Affiliation unitDepartment of Biotechnology and Bioprocess Engineering (DBBE)
Study subject / specializationBiotechnologia Przemysłowa
Languageen angielski
StatusFinished
Defense Date22-10-2013
Issue date (year)2013
Keywords in Polish-
Keywords in English-
Abstract in PolishBakterie Escherichia coli są powszechnie wykorzystywane do produkcji rekombinowanych białek, znajdujących szerokie zastosowanie w medycynie i przemyśle spożywczym, farmaceutycznym i biotechnologicznym. Etap efektywnego wydzielania wewnątrzkomórkowego produktu białkowego z komórek namnożonej biomasy decyduje o opłacalności całego procesu produkcji. W celu wydzielenia białka stosuje się dezintegrację komórek przeprowadzoną metodami mechanicznymi, fizycznymi, chemicznymi lub enzymatycznymi. W przypadku badań, których przedmiotem są białka rekombinowane istotne jest otrzymanie materiału badawczego w dostatecznej ilości. Konieczne jest zatem zastosowanie skutecznej metody dezintegracji komórek. Metodyka planowania eksperymentów stosowana w wysokosprawnych technologiach (ang. high-throughput technologies) znajduje coraz powszechniejsze zastosowanie w naukach przyrodniczych, w tym przede wszystkim w biotechnologii i inżynierii bioprocesowej. Umożliwia ona realizację wielu równoczesnych eksperymentów w małej skali, co przekłada się na niższe koszty i wydatne skrócenie czasu badań. Celem pracy była optymalizacja metodyki chemicznej dezintegracji komórek E. coli opracowanej pod kątem maksymalizacji ilości uwolnionego z komórek bakterii bioproduktu białkowego oraz zachowania przez jego cząsteczki aktywności enzymatycznej. Przeprowadzono szereg eksperymentów, w celu znalezienia optymalnego składu buforu lizującego, który potencjalnie mógłby być zastosowany do dezintegracji komórek. W badaniach, jako czynniki niszczące elementy ściany komórkowej bakterii, wykorzystano związki powszechnie stosowane do dezintegracji komórek: EDTA, lizozym, polimyksynę B, chlorowodorek guanidyny i detergent Tween 20. Do zaplanowania zestawu doświadczeń wykorzystano aplikację statystyczną MODDE, działającą w oparciu o założenia planowania eksperymentów (DOE). Zastosowanie zautomatyzowanego robota laboratoryjnego typu Hamilton StarLine pozwoliło uzyskać próbki buforów lizujących różniących się składem, które następnie wykorzystano do dezintegracji komórek E. coli. W celu oceny efektywności procesu lizy komórek, przeprowadzono analizę ilościową uwolnionego z komórek modelowego białka enzymatycznego (β-galaktozydazy) oraz oznaczono jego aktywność. Statystyczna obróbka wyników przeprowadzonych doświadczeń zaproponowanie optymalnego składu buforu. Jego skuteczność została ilościowo porównana z efektami lizy komórek E. coli przeprowadzanej komercyjnie dostępnym preparatem lizującym BugBuster® (Merck) oraz metodami wybranymi mechanicznymi (dezintegracją ultradźwiękową i mieleniem w młynie kulowym). Uzyskane wyniki wskazują, że dezintegracja metodami chemicznymi jest skutecznym sposobem wydzielania produktów białkowych z komórek. Użycie preparatu BugBuster® dało lepsze wyniki niż obie metody mechaniczne, zarówno w zakresie ilości uwolnionego z komórek bioproduktu jak i jego aktywności. Natomiast dzięki zastosowaniu opracowanego w toku eksperymentów buforu lizującego, zawierającego lizozym, EDTA, Tween 20 i polimyksynę B uzyskano ponad 200 % więcej białka enzymatycznego, które zachowywało aktywność w ponad 50 % większą w porównaniu z bioproduktem białkowym uzyskanym po zastosowaniu preparatu BugBuster®.
File
Wojciech Stępień - Praca magisterska.pdf 2.22 MB

Get link to the record
msginfo.png

Back