Knowledge base: Warsaw University of Technology

Settings and your account

Back

The study on the NikA protein interaction with the pCTX-M3 plasmid oriT region

Weronika Augustyniak

Abstract

The pCTX-M3 conjugative plasmid of the incompatibility group IncL/M has a great impact on the spread of β-lactam and aminoglycoside antibiotic resistance genes among bacteria. The appearance of multi-drug resistant bacteria, or even bacteria resistant to all used antibiotics is a result of the acquisition of antibiotic resistance genes. A detailed analysis of the conjugative transfer process and understanding of principles and mechanisms that govern it, could lead to finding methods to reduce the transmission of resistance genes. Ability to influence the conjugative transfer could in turn greatly extend "the life time" of the next generation antibiotics. The pCTX-M3 plasmid carries a conjugative transfer system which is classified, together with group IncI1 plasmids conjugative systems, to poorly characterized type IVB of secretion systems. Genes encoding the pCTX-M3 conjugative system are located in two plasmid regions: tra and trb, and their protein products display 30-60% similarity to proteins of the R64 plasmid system, of the IncI1 group. The product of the first gene of the tra conjugative operon of pCTX-M3 is the NikA protein. This protein is an auxiliary protein of a nicking enzyme (relaxase, nikase), NikB - an enzyme which plays an important role in the conjugation process; it cuts DNA within a specific oriT sequence. It is known that the NikA protein of the R64 plasmid binds to the specific DNA - the oriTR64 region and thereby enables NikB binding. Due to this fact, the NikA protein plays an important role in the initiation of conjugation process. During the research, plasmids based on a polymerase and phage T7 promotor, dedicated for overproduction of the NikA and 6xH-NikA (the NikA protein with the hexahistidine tag fused at the amino-terminus of the protein) proteins were constructed. Overproduction of both proteins in E. coli cells was induced successfully. It was found that both the NikA and 6xH-NikA proteins bind to a region located between the nikA and orf35 genes–(orf35 is a gene of the pCTX-M3 leading region). With the use of fragments of different length, covering mentioned above region, the oriTpCTX-M3 sequence to which the NikA protein binds was indicated. The precise determination of the NikA protein binding site within oriTpCTX-M3 requires further research. Furthermore, it was shown that the 6xH-NikA hybrid protein constructed in this work also has the ability to bind oriTpCTX-M3.
Diploma type
Engineer's / Bachelor of Science
Diploma type
Engineer's thesis
Author
Weronika Augustyniak (FC) Weronika Augustyniak,, Faculty of Chemistry (FC)
Title in Polish
Badanie oddziaływania białka NikA w rejonie oriT plazmidu pCTX-M3
Supervisor
Monika Wielechowska (FC/CDSB) Monika Wielechowska,, Chair of Drug and Cosmetics Biotechnology (FC/CDSB)Faculty of Chemistry (FC)
Certifying unit
Faculty of Chemistry (FC)
Affiliation unit
Department Of Drug Technology And Biotechnology (FC/CDSB)
Study subject / specialization
, Biotechnologia
Language
(pl) Polish
Status
Finished
Defense Date
01-02-2016
Issue date (year)
2016
Reviewers
Michał Chudy (FC/CMB) Michał Chudy,, Chair of Medical Biotechnology (FC/CMB)Faculty of Chemistry (FC) Monika Wielechowska (FC/CDSB) Monika Wielechowska,, Chair of Drug and Cosmetics Biotechnology (FC/CDSB)Faculty of Chemistry (FC)
Keywords in Polish
koniugacja, geny oporności, plazmidy
Keywords in English
conjugation,resistance genes, plasmids
Abstract in Polish
Koniugacyjny plazmid pCTX-M3 należący do grupy niezgodności IncL/M ma duży wpływ na rozprzestrzenianie się wśród bakterii genów oporności na antybiotyki β-laktamowe i aminoglikozydowe. Efektem nabywania genów oporności na antybiotyki jest pojawianie się bakterii wielolekoopornych, a nawet wykazujących oporność na wszystkie stosowane antybiotyki. Dokładna analiza samego procesu transferu koniugacyjnego oraz zasad i mechanizmów nim rządzących może doprowadzić do znalezienia metod pozwalających na ograniczenie przekazywania genów oporności. Możliwość wpływania na transfer koniugacyjny mogłaby z kolei znacznie wydłużyć „czas życia” kolejnych generacji antybiotyków. Plazmid pCTX-M3, niesie system transferu koniugacyjnego zaklasyfikowany, wspólnie z systemem koniugacyjnym plazmidów z grupy IncI1, do słabo poznanej grupy systemów sekrecji typu IVB. Geny kodujące system koniugacyjny pCTX-M3 są zgrupowane w dwóch rejonach plazmidu: tra i trb, a ich białkowe produkty wykazują 30-60% podobieństwa do białek systemu z plazmidu R64, z grupy IncI1. Produktem pierwszego genu operonu koniugacyjnego tra plazmidu pCTX-M3, jest białko NikA. Białko to jest białkiem pomocniczym nikazy (relaksazy) NikB – enzymu odgrywającego ważną rolę w procesie koniugacji, prowadzącego nacięcie DNA w obrębie sekwencji oriT. Wiadomo, że białko NikA z plazmidu R64 wiąże się do specyficznych sekwencji DNA regionu oriT R64, a przez to umożliwia wiązanie nikazy. Ze względu na to, białko NikA pełni istotną rolę w inicjacji koniugacji. W trakcie przeprowadzonych badań skonstruowano plazmid do nadprodukcji białka NikA oraz białka 6xH-NikA, czyli NikA ze znacznikiem heksahistydynowym dołączonym na końcu aminowym białka, w systemie opartym na polimerazie i promotorze faga T7. Doprowadzono do nadprodukcji obu białek w komórkach E. coli. Ustalono, że zarówno NikA jak i 6xH-NikA wiążą się z odcinkiem pomiędzy genem nikA a orf35 - genem z rejonu wiodącego pCTX-M3. Stosując fragmenty o różnej długości, pokrywające ten odcinek, wskazano rejon oriT pCTX-M3, do którego białko NikA ulega wiązaniu. Precyzyjna lokalizacja miejsca wiązania białka NikA w obrębie oriT pCTX-M3 wymaga dalszych badań. Ponadto pokazano, że skonstruowane w tej pracy białko hybrydowe 6xH-NikA również ma zdolność wiązania oriT pCTX-M3.
File
  • File: 1
    Weronika Augustyniak - Badanie oddziaływania białka NikA w rejonie oriT plazmidu pCTX-M3.pdf
Request a WCAG compliant version
Local fields
Identyfikator pracy APD: 8531

Uniform Resource Identifier
https://repo.pw.edu.pl/info/bachelor/WUTc8c325b26ab74b789c22969c07ee0c96/
URN
urn:pw-repo:WUTc8c325b26ab74b789c22969c07ee0c96

Confirmation
Are you sure?
Report incorrect data on this page