Knowledge base: Warsaw University of Technology

Settings and your account

Back

Mechanisms of incorporation and removal of ribonucleotides from DNA in Escherichia coli cells

Krystian Łazowski

Abstract

In recent years, it has been shown that the presence of ribonucleotides in DNA is an important factor affecting genetic stability of the cells. DNA polymerases can insert ribonucleotides into DNA during replication process. The selectivity of DNA polymerases is associated with the presence of the steric gate residue, which contributes to the discrimination of nucleotides with wrong sugar. Using a steric gate mutant of DNA polymerase V (Pol V Y11A), and the lacZ system that allows to measure the frequency and the specificity of mutagenesis on both DNA strands, the mechanisms of incorporation and removal of ribonucleotides from DNA in E. coli cells have been examined. To that end, the effect of Pol V Y11A mutant and wild–type Pol V on in vivo mutation rate on both DNA strands, in strains expressing or lacking RNase HII (the main enzyme that detects ribonucleotides within DNA), have been compared. It has been shown in this thesis that Pol V Y11A mutant, same as wild–type Pol V, contributes preferentially to the synthesis of lagging DNA strand; however, it can also take a limited part in the leading DNA strand replication. The presence of Pol V Y11A mutant (which is capable of misinserting ribonucleotides as well as mismatched deoxyribonucleotides in vitro) results in the reduction of mutation rate in vivo, in comparison with strains expressing wild–type Pol V. The antimutator effect of Y11A mutant is stronger on the lagging strand. The deficiency of RNase HII in Pol V Y11A mutant leads to the increase of mutagenesis, but not to the levels observed in strain expressing wild–type Pol V. The effect of the activity of RNase HII–dependent RER is larger on lagging DNA strand. Based on the obtained results it is concluded that the presence of ribonucleotides in DNA, which are misinserted during Pol V Y11A–mediated replication, triggers the activation of the ribonucleotide excision repair (RER) pathway. RER removes ribonucleotides (misinserted by Pol V Y11A mutant) as well as mismatched deoxyribonucleotides located nearby. Because of the greater level of ribonucleotides misinserted by Pol V Y11A into the lagging strand, the RER pathway is more often engaged on this strand. The results obtained in this work also indicate that the RNase HII–dependent RER is not the only pathway involved in removing ribonucleotides misinserted by Pol V Y11A mutant during DNA replication.
Diploma type
Engineer's / Bachelor of Science
Diploma type
Engineer's thesis
Author
Krystian Łazowski (FC) Krystian Łazowski,, Faculty of Chemistry (FC)
Title in Polish
Mechanizmy inkorporacji i usuwania rybonukleotydów w DNA w komórkach Escherichia coli
Supervisor
Małgorzata Adamczyk (FC/CDSB) Małgorzata Adamczyk,, Chair of Drug and Cosmetics Biotechnology (FC/CDSB)Faculty of Chemistry (FC)
Certifying unit
Faculty of Chemistry (FC)
Affiliation unit
Department Of Drug Technology And Biotechnology (FC/CDSB)
Study subject / specialization
, Biotechnologia
Language
(pl) Polish
Status
Finished
Defense Date
05-02-2016
Issue date (year)
2016
Reviewers
Małgorzata Adamczyk (FC/CDSB) Małgorzata Adamczyk,, Chair of Drug and Cosmetics Biotechnology (FC/CDSB)Faculty of Chemistry (FC) Joanna Cieśla (FC/CDSB) Joanna Cieśla,, Chair of Drug and Cosmetics Biotechnology (FC/CDSB)Faculty of Chemistry (FC)
Keywords in Polish
inkorporacja rybonukleotydów, rybonukleotydy w DNA, usuwanie rybonukleotydów z DNA, polimeraza DNA V
Keywords in English
incorporation of ribonucleotides, ribonucleotides in DNA, removal of ribonucleotides from DNA, DNA V polymerase
Abstract in Polish
W ostatnich latach wykazano, że ważnym czynnikiem wpływającym na stabilność genetyczną komórek jest obecność rybonukleotydów w DNA. Polimerazy DNA zdolne są do wstawiania rybonukleotydów do DNA w trakcie procesu replikacji. Selektywność polimeraz DNA związana jest z obecnością bramki sterycznej, która bierze udział w dyskryminacji nukleotydów z nieprawidłowym cukrem. Używając mutanta w bramce sterycznej polimerazy DNA V (Pol V Y11A) oraz systemu lacZ służącego do pomiaru częstości i specyficzności mutagenezy na obydwu niciach DNA, badano mechanizmy odpowiedzialne za inkorporację i usuwanie rybonukleotydów z DNA w komórkach E. coli. W tym celu porównano wpływ mutanta Pol V Y11A oraz Pol V typu dzikiego na poziom mutagenezy in vivo na obydwu niciach DNA, w szczepach z aktywną i nieaktywną RNazą HII (głównym enzymem rozpoznającym rybonukleotydy w DNA). W pracy wykazano, że mutant Pol V Y11A, podobnie jak Pol V typu dzikiego, bierze preferencyjnie udział w syntezie nici opóźnionej; może brać także ograniczony udział w replikacji nici wiodącej. Obecność mutanta Pol V Y11A (zdolnego do wstawiania rybonukleotydów i błędnie sparowanych deoksyrybonukleotydów in vitro) powoduje obniżenie mutagenezy in vivo w porównaniu do szczepów eksprymujących Pol V typu dzikiego. Silniejszy efekt antymutatorowy mutanta Y11A obserwowany jest na nici opóźnionej. Brak aktywności RNazy HII w mutancie Pol V Y11A powoduje wzrost mutagenezy, jednak nie do poziomu obserwowanego w szczepie niosącym Pol V typu dzikiego. Silniejszy efekt działania systemu RER zależnego od RNazy HII obserwuje się na nici opóźnionej. Na podstawie uzyskanych wyników wnioskuje się, że obecność rybonukleotydów w DNA wstawionych podczas replikacji prowadzonej przez Pol V Y11A prowadzi do aktywacji ścieżki naprawy przez wycięcie rybonukleotydu (RER). System RER usuwa wstawione przez Pol V Y11A rybonukleotydy oraz znajdujące się w pobliżu błędnie sparowane deoksyrybonukleotydy. W związku z większą liczbą rybonukleotydów wstawianych przez Pol V Y11A na nici opóźnionej, system RER jest częściej angażowany na tej nici. Uzyskane wyniki wskazują także, że ścieżka RER zależna od RNazy HII nie jest jedynym systemem zaangażowanym w usuwanie z DNA rybonukleotydów wstawianych przez mutanta Pol V Y11A.
File
  • File: 1
    Krystian Łazowski Praca inżynierska 2016.pdf
Request a WCAG compliant version
Local fields
Identyfikator pracy APD: 8556

Uniform Resource Identifier
https://repo.pw.edu.pl/info/bachelor/WUTbe9bcd3acd9a41cb9162ebd3350618ca/
URN
urn:pw-repo:WUTbe9bcd3acd9a41cb9162ebd3350618ca

Confirmation
Are you sure?
Report incorrect data on this page