Knowledge base: Warsaw University of Technology

Settings and your account

Back

Studies on subcellular localization of cis-prenyltransferase in Arabidopsis thaliana

Katarzyna Anna Mańko

Abstract

Polyisoprenoids are linear polymers of five-carbon isoprene units. Isopentenyl diphosphate (IPP), molecule which serves as substrate during their chain elongation, is formed via the cytosolic mevalonate pathway (MVA) and the plastidial methylerythritol phosphate pathway (MEP). Polyisoprenoids are divided into two groups: polyprenols – allylic alcohols, possessing a single double bond in each isoprene unit and dolichols with one hydrogenated double bond in the OH-terminal isoprene unit. Polyprenols are present mainly in bacteria and plant photosynthetic tissues whereas dolichols - in animal and yeast cells as well as in plant roots. The key enzymes responsible for elongation of polyisoprenoid chains are prenyltransferases. Trans-prenyltransferases catalyze the synthesis of products containing 3 or 4 trans units (di-trans or tri-trans configuration). These compounds are further used as substrates by cis-prenyltransferases which add desired number of isoprene units in cis configuration and form long chain, di-trans-poli-cis or tri-trans-poli-cis, polyisoprenoids. So far, a few plant cis-prenyltransferases have been characterized, seven in tomato (SICPT1-7), one in Lilium logiflorum (LAA66), two in Hevea brasiliensis (HRT1-2) and three in Taraxacum koksaghyz (TkCPT1-3). Nine genes encoding putative cis-prenyltransferases have been identified in Arabidopsis thaliana genome (AtCPT1-9), two of them (AtCPT1 and AtCPT6) have been partially characterized. Experimental part of this work was focus on identification of the subcellular localization of AtCPT1. To this end coding sequence of AtCPT1 was amplified using total RNA as a template and cloned into the pENTR vector. To obtaine AtCPT1-GFP fusion protein the homologous recombination of AtCPT1 insert from pENTR to plant expression binary vectors ImpGWB was applied. Obtained constructs were introduced into bacteria Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 using the freeze/thaw method. Agrobacterium cells were infiltrated by injection into the bottom side of leaf of Nicotiana benthamiana plants in order to achieve transient expression of genes of interest. The organelle-specific localization of AtCPT1/GFP was studied in confocal laser microscope. The co-localization of fluorescence signals of AtCPT1/GFP protein and fluorescent ER-marker protein (ER-mCherry) showed that AtCPT1 was localized to endoplasmic reticulum.
Diploma type
Engineer's / Bachelor of Science
Diploma type
Engineer's thesis
Author
Katarzyna Anna Mańko (FC) Katarzyna Anna Mańko,, Faculty of Chemistry (FC)
Title in Polish
Badanie lokalizacji wewnątrzkomórkowej cis-prenylotransferaz u Arabidopsis thaliana
Supervisor
Patrycja Wińska (FC/CDSB) Patrycja Wińska,, Chair of Drug and Cosmetics Biotechnology (FC/CDSB)Faculty of Chemistry (FC)
Certifying unit
Faculty of Chemistry (FC)
Affiliation unit
Department Of Drug Technology And Biotechnology (FC/CDSB)
Study subject / specialization
, Biotechnologia
Language
(pl) Polish
Status
Finished
Defense Date
01-02-2016
Issue date (year)
2016
Reviewers
Patrycja Wińska (FC/CDSB) Patrycja Wińska,, Chair of Drug and Cosmetics Biotechnology (FC/CDSB)Faculty of Chemistry (FC) Elżbieta Wałajtys-Rode (FC/CDSB) Elżbieta Wałajtys-Rode,, Chair of Drug and Cosmetics Biotechnology (FC/CDSB)Faculty of Chemistry (FC)
Keywords in Polish
poliizoprenoidy, cis-prenylotransferazy, Arabidopsis thaliana
Keywords in English
polyisoprenoids, cis-prenyltransferases, Arabidopsis thaliana
Abstract in Polish
Poliizoprenoidy to liniowe polimery zbudowane z pięciowęglowych reszt izoprenowych. Podstawowym substratem w syntezie łańcucha węglowego poliizoprenoidów jest difosforan izopentenylu (IPP), który powstaje niezależnie jako produkt dwóch szlaków metabolicznych: cytozolowego szlaku mewalonowego (MPV) oraz plastydowego szlaku fosforanu metyloerytroitylu (MEP). Ze względu na obecność podwójnego wiązania przy alfa reszcie izoprenowej poliizoprenoidy dzieli się na dwie grupy: alfa-nienasycone dolichole i alfa-nasycone poliprenole. Poliprenole występują głównie w fotosyntetyzujących tkankach roślinnych i komórkach bakteryjnych, natomiast dolichole wykrywane są głównie w komórkach zwierzęcych, drożdżowych i korzenia roślin. Enzymami odpowiedzialnymi za elongację łańcucha węglowego poliizoprenoidów są prenylotransferazy. Trans-prenylotransferazy katalizują syntezę produktów złożonych z 2-3 reszt izoprenowych w konfiguracji trans (di-trans lub tri-trans), które następnie są wydłużane przy udziale cis prenylotransferaz do dłuższych łańcuchów poliizoprenoidowych (di-trans-poli-cis lub tri-trans-poli-cis). Do tej pory scharakteryzowano kilka CPT roślinnych, siedem w pomidorze (SlCPT1-7), jedną u Lilium logiflorum (LAA66), dwie u Hevea brasiliensis (HRT1-2) oraz trzy w Taraxacum koksaghyz (TkCPT1-3). W genomie Arabidopsis thaliana występuje dziewięć cis prenylotransferaz (AtCPT1-9), z których tylko dwie (AtCPT1 i AtCPT6) zostały częściowo scharakteryzowane. Część badawcza niniejszej pracy polegała na lokalizacji wewnątrzkomórkowej AtCPT1. Sekwencję kodującą AtCPT1 zamplifikowano na matrycy całkowitego RNA wyizolowanego z korzenia A. thaliana, a następnie wklonowano do wektora przejściowego pENTR. W celu uzyskania fuzyjnego białka AtCPT1 wyznakowanego fluorescencyjnie GFP przeprowadzono rekombinację homologiczną wstawki z pENTR do wektorów binarnych ImpGWB ulegających ekspresji w komórkach roślinnych. Otrzymanymi konstruktami przy użyciu metody freeze/thaw, transformowano Agrobacterium tumefaciens GV3101, którymi następnie infiltrowano liście Nicotiana benthamiana. Analizę lokalizacji AtCPT1 przeprowadzono w mikroskopie konfokalnym. Wykazano koekspresję AtCPT1 wyznakowanego białkiem GFP z białkiem markerowym dla siateczki śródplazmatycznej (ER-mCherry), co świadczy o lokalizacji AtCPT1 w tym kompartmencie komórkowym.
File
  • File: 1
    K.Mańko_praca_inżynierska.pdf
Request a WCAG compliant version
Local fields
Identyfikator pracy APD: 8560

Uniform Resource Identifier
https://repo.pw.edu.pl/info/bachelor/WUTb94149aa550e4850b52bd3c7c63aec15/
URN
urn:pw-repo:WUTb94149aa550e4850b52bd3c7c63aec15

Confirmation
Are you sure?
Report incorrect data on this page