Knowledge base: Warsaw University of Technology

Settings and your account

Back

Optimization of recombinant virus-like nanoparticle purification

Monika Lasocka

Abstract

During the life cycle of adenovirus serotype 3 (Ad3), virus-like particles (VLPs) called dodecahinedron-fiber (DF) are formed spontaneously. Dodecahedera are composed of 12 pentons, complexes of pentameric penton bases (Pbs), and trimeric fibers that are responsible for the virus penetration into cells. As a result of the expression of Ad3 proteins in the baculovirus system DF can be produced as well as Dd, which is a dodecahedron composed only of pentametric penton bases. Dd has an exeptional ability to penetrate into cells using heparan sulfates (HS) and αv integrins as receptors. Drugs used for the chemotherapy such as bleomycin and doxorubicin inefficiently pass through the cell membrane, showing low specificity, and also causing numerous serious side effects that can lead to patient’s death. The bioavailability of anticancer drugs, i.e. the extent to which the drugs are absorbed by the body, can be increased by using an efficient vector, which is the main advantage of the biological vectors. The main purpose of using Dd is to increase the efficiency of the drug delivery to cancer cells, increase their bioavailability and limit the effective dose. The vector application for the therapeutic purposes requires the development of both efficient and fast vector purification method. The main goal of this work was to improve the Dd purification method in order to increase its efficiency. The previously developed procedure was two-staged and based on the fast protein liquid chromatography (FPLC). The first step included the purification of Dd using the size-exclusion chromatography (SEC) dependent on the size and shape of the particle. The second step, on the other hand, was the purification of Dd using an ion-exchange chromatography (IEC) dependent on the particle charge. The first stage of the optimization process was the use of Viscolase, an endonuclease, added to Dd purified by the SEC column beforehand. The goal was to increase the efficiency of Dd purification by the IEC column where the particle is purified from the nucleic acids. Unfortunately, the incubation of Dd with Viscolase led to the particle decomposition into pentameric penton bases which was the reason not to use the enzyme in the further research. The next stage of the optimization process was Dd purification with attached histidine tag (Dd-His) which then was purified by the Ni-NTA column. The use of the affinity chromatography limited the number of the purification stages to one. In addition, the amount of lost protein during the purification process has been reduced and the time of the whole process has also been limited from several days to several hours.
Diploma type
Engineer's / Bachelor of Science
Diploma type
Engineer's thesis
Author
Monika Lasocka (FC) Monika Lasocka,, Faculty of Chemistry (FC)
Title in Polish
Optymalizacja oczyszczania rekombinowanej nanocząstki wirusopodobnej
Supervisor
Patrycja Wińska (FC/CDSB) Patrycja Wińska,, Chair of Drug and Cosmetics Biotechnology (FC/CDSB)Faculty of Chemistry (FC)
Certifying unit
Faculty of Chemistry (FC)
Affiliation unit
Chair of Drug and Cosmetics Biotechnology (FC/CDSB)
Study subject / specialization
, Biotechnologia
Language
(pl) Polish
Status
Finished
Defense Date
04-02-2019
Issue date (year)
2019
Reviewers
Patrycja Wińska (FC/CDSB) Patrycja Wińska,, Chair of Drug and Cosmetics Biotechnology (FC/CDSB)Faculty of Chemistry (FC) Mariusz Pietrzak (FC/CMB) Mariusz Pietrzak,, Chair of Medical Biotechnology (FC/CMB)Faculty of Chemistry (FC)
Keywords in Polish
cząstka wirusopodobna dodekahedron, wiskolaza, wysokosprawna chromatografia cieczowa, kolumna wykluczenia, kolumna jonowymiennna, kolumna niklowa
Keywords in English
virus-like particle, dodecahedron, Viscolase, fast protein liquid chromatography, size-exclusion chromatography, ion-exchange chromatography, Ni-NTA column
Abstract in Polish
W trakcie cyklu życiowego adenowirusa serotypu 3 (Ad3) w sposób spontaniczny powstają cząsteczki wirusopodobne (VLP) zwane dodekahedron-fiber (DF). Dodekahedrony są zbudowane z kompleksu 12 pentamerów białka podstawy pentonu (Pb), i trymerycznego białka włókna, które są odpowiedzialne za wnikanie wirusa do komórek. W wyniku ekspresji białek Ad3 w systemie bakulowirusowym można otrzymać DF, jak również dodekahedron zbudowany tylko z pentametrycznych białek podstawy pentonu (Dd). Dd posiadają niezwykłą zdolność wnikania do komórek dzięki wykorzystaniu jako receptorów siarczanów heparanu (HS) oraz integryn αv. Stosowane w chemioterapii leki przeciwnowotworowe, takie jak bleomycyna czy doksorubicyna nieefektywnie przenikają przez błony komórkowe, wykazując małą specyficzność, a także powodując liczne ciężkie skutki uboczne mogące doprowadzić do śmierci pacjenta. Biodostępność leków przeciwnowotworowych, czyli stopień w jakim są one wchłaniane przez organizm, może być zwiększona przez użycie wydajnego wektora, co stanowi główną zaletę wektorów biologicznych. Zastosowanie Dd pozwala na istotny wzrost efektywności dostarczania leków do komórek nowotworowych, zwiększa ich biodostępność, a także ogranicza efektywną dawkę, co skutkuje zmniejszeniem częstości występowania skutków ubocznych. Zastosowanie wektora do celów terapeutycznych wymaga opracowania skutecznej, wydajnej i szybkiej metody oczyszczania wektora. Głównym celem niniejszej pracy było usprawnienie metody oczyszczania Dd, tak aby zwiększyć jego efektywność. Wcześniej opracowana procedura była dwuetapowa i bazowała na wysokosprawnej chromatografii cieczowej (FPLC). Pierwszy etap stanowiło oczyszczanie Dd na kolumnie wykluczenia (SEC), które jest zależne od wielkości i kształtu cząstki. Natomiast drugi etap polegał na oczyszczaniu Dd na kolumnie jonowymiennej (IEC), które jest zależne od ładunku cząstki. Pierwszym etapem optymalizacji procesu było zastosowanie wiskolazy, czyli endonukleazy, dodawanej do oczyszczonych na kolumnie SEC frakcji Dd. Miało to na celu zwiększenie efektywności oczyszczania Dd na kolumnie IEC, gdzie cząstka jest oczyszczana z kwasów nukleinowych. Niestety inkubowanie Dd z wiskolazą prowadziło do rozkładu cząstki na białka podstawy pentonu, co uniemożliwiło korzystanie z enzymu. Następnie zastosowano oczyszczanie Dd z przyłączoną metką histydynową (Dd-His) korzystając z chromatografii powinowactwa na kolumnie niklowej, co ograniczyło liczbę etapów oczyszczania cząstki do jednego. Oprócz korzyści związanej ze zmniejszoną ilością traconego białka w trakcie trwania procesu, skrócono też czas całej procedury z kilku dni do kilku godzin.
File
  • File: 1
    praca_inż_-_Lasocka_Monika_-_276153.pdf
Request a WCAG compliant version
Local fields
Identyfikator pracy APD: 28352

Uniform Resource Identifier
https://repo.pw.edu.pl/info/bachelor/WUTa2838dae356e4874b9c046f44f729279/
URN
urn:pw-repo:WUTa2838dae356e4874b9c046f44f729279

Confirmation
Are you sure?
Report incorrect data on this page