Knowledge base: Warsaw University of Technology

Settings and your account

Back

praca utajniona

Kinga Karolina Głuchowska

Abstract

The thesis describes the process of designing a construct and obtaining a recombinant protein in a bacterial expression system. The analyzed protein was lipase 628 from Psychrobacter cryohalolentis 11E8b, which sequence was established on the basis of similarity to genome K5T. Also, PCR starters, used for amplification of lipase coding sequence, were designed on the basis of K5T genome. The next step was ligation of the pET28a(+) plasmid with two DNA fragments - the sequence responsible for coding the protein with the autotransporting domain or only the sequence responsible for coding the enzyme. The constructs, prepared in this way, were introduced into E. coli DH5α cells. As a result of the transformation, three colonies were grown, of which the only one received the plasmid containing the sequence responsible for coding the potential lipase. Obtained recombinant was propagated and analyzed. Restrictive digests and sequencing were done. The results of the analyzes confirmed the 78% similarity of the cloned fragment to the WP _011513219 coding sequence (lipase 628) from P. cryohalolentis K5T. Bioinformatic analysis of cloned sequence decided on an attempt of lipase overproduction. Overproduction was made in E. coli BL21 (DE3) pLysS cells by induction of 1M IPTG. One portion of the cells was shaken for 3 hours at 37 °C and the other for 20 hours at 20 °C. The bacterial suspension was centrifugated. After that, pellet was lysed to receive extract and dissolved fraction, which were analyzed by SDS-PAGE. In both fractions the visible band, at the expected height, was not observed. Additionally, the band layout before and after the induction was very similar. To sum up, a recombinant sequence, coding for a potential lipase 628 was cloned in pET28a(+) vector, however overproduction of the target protein was unsuccessful.
Diploma type
Engineer's / Bachelor of Science
Diploma type
Engineer's thesis
Author
Kinga Karolina Głuchowska (FC) Kinga Karolina Głuchowska,, Faculty of Chemistry (FC)
Supervisor
Małgorzata Milner-Krawczyk (FC/CDSB) Małgorzata Milner-Krawczyk,, Chair of Drug and Cosmetics Biotechnology (FC/CDSB)Faculty of Chemistry (FC)
Certifying unit
Faculty of Chemistry (FC)
Affiliation unit
Chair of Drug and Cosmetics Biotechnology (FC/CDSB)
Study subject / specialization
, Biotechnologia
Language
(pl) Polish
Status
Finished
Defense Date
29-01-2019
Issue date (year)
2019
Reviewers
Małgorzata Milner-Krawczyk (FC/CDSB) Małgorzata Milner-Krawczyk,, Chair of Drug and Cosmetics Biotechnology (FC/CDSB)Faculty of Chemistry (FC) Karolina Chreptowicz (FC/CDSB) Karolina Chreptowicz,, Chair of Drug and Cosmetics Biotechnology (FC/CDSB)Faculty of Chemistry (FC)
Keywords in Polish
lipaza, Psychrobacter cryohalolentis, 11E8b, plazmid pET28a(+)
Keywords in English
lipase, Psychrobacter cryohalolentis, 11E8b, plasmid pET28a(+)
Abstract in Polish
W pracy opisano metodę zaprojektowania konstruktu i otrzymania rekombinowanego białka w bakteryjnym systemie ekspresyjnym. Analizowano lipazę 628 ze szczepu Psychrobacter cryohalolentis 11E8b, której sekwencję ustalono na podstawie podobieństwa do szczepu K5T i na podstawie jego genomu zaprojektowano startery, wykorzystane w reakcji PCR. Następnie w reakcjach ligacji połączono plazmid pET28a(+) z dwoma fragmentami DNA – sekwencją odpowiedzialną za kodowanie białka wraz z sekwencją kodującą domenę autotransportującą lub tylko z sekwencją odpowiedzialną za kodowanie enzymu. Tak przygotowane konstrukty wprowadzono do komórek E. coli DH5α. W wyniku transformacji otrzymano trzy kolonie, z czego tylko jedna przyjęła plazmid zawierający sekwencję odpowiedzialną za kodowanie potencjalnej lipazy. Uzyskanego rekombinanta namnożono i poddano dalszej analizie. Przeprowadzono trawienie restrykcyjne oraz sekwencjonowanie. Zarówno jedna, jak i druga metoda, potwierdziły obecność sekwencji w ok 78% podobnej do sekwencji białka WP _011513219 (lipaza 628) szczepu P. cryohalolentis K5T. Mając sekwencję przeprowadzono analizę bioinformatyczną, która zdecydowała o podjęciu próby nadprodukcji białka. Nadprodukcję prowadzono w szczepie E. coli BL21(DE3)pLysS indukując komórki 1M IPTG. Jedną porcję komórek wytrząsano przez 3 godziny w temperaturze 37°C, a drugą przez 20 godzin w 20°C. Osad bakteryjny uzyskany po wirowaniu, poddano lizie, w celu przeanalizowania ekstraktu i frakcji rozpuszczonej metodą elektroforezy w warunkach denaturujących. W obydwu frakcjach nie zaobserwowano wyraźnego prążka na oczekiwanej wysokości. Dodatkowo układ prążków przed i po indukcji niewiele się różnił. Ostatecznie uzyskano rekombinanta, który nie umożliwił nadprodukcji docelowego białka w wykorzystanym systemie ekspresyjnym.
File
  • File: 1
    pracainż-GłuchowskaKinga-276143.pdf
Request a WCAG compliant version
Local fields
Identyfikator pracy APD: 28302

Uniform Resource Identifier
https://repo.pw.edu.pl/info/bachelor/WUT940210d793954f289a8be65c8c59436a/
URN
urn:pw-repo:WUT940210d793954f289a8be65c8c59436a

Confirmation
Are you sure?
Report incorrect data on this page