Knowledge base: Warsaw University of Technology

Settings and your account

Back

Optimization of GluR2 ligand binding domain overexpression in Escherichia coli

Łukasz Michał Łężniak

Abstract

Glutamate is one of the most important excitatory transmitters in the mammalian central nervous system. Besides playing a key role in the fast synaptic transmission it takes part in the regulation of many crucial processes like proliferation, migration, differentiation and survival of neural progenitor cells and also in learning and memory. The main receptors of glutamatergic system are AMPA receptors which are the ionotropic glutamate receptors selectively activated by α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid. AMPA receptors are tetramers made up of combinations of four subunits: GluR1, GluR2, GluR3, GluR4. A large body of evidence indicates that faulty working glutamate receptors are involved in a number of brain diseases like Alzheimer’s, Parkinson’s and Huntington’s disease, epilepsy and some types of cancer. For this reason, the new antagonist ligands for glutamate receptors, that could be used in the future as efficient drugs in those diseases, are still searched for. Since using cell cultures is an expensive way for study the activity of potential antagonists, the recombinant subtypes of glutamate receptors might be used instead. Bacterial expression system is very useful for the production of many soluble proteins, but overexpression of membrane proteins in this host may result in the production of inclusion bodies formed by misfolded proteins. Hence, many different methods for enhancing the solubility of heterologous proteins have been developed. The aim of this work was to optimize the production of proper folded HS1S2 GluR2 ligand binding domain in soluble form. To achieve this goal, the overproduction of this protein was performed with the co-expression of chaperones. The obtained results showed that co-expression of the Trigger factor chaperone (Tf) allows for overproduction of the GluR2 HS1S2 binding domain in a soluble form capable of binding ligands. HS1S2 formulations with different degrees of purity were obtained by affinity chromatography. Testing the ability of the obtained preparations to bind 3H-AMPA in the presence of glutamic acid revealed that some of them have 3H-AMPA binding ability. The obtained results allow using the developed method for overproduction of the HS1S2 binding domain able to be used in studies of new glutamatergic receptor antagonists.
Diploma type
Engineer's / Bachelor of Science
Diploma type
Engineer's thesis
Author
Łukasz Michał Łężniak (FC) Łukasz Michał Łężniak,, Faculty of Chemistry (FC)
Title in Polish
Optymalizacja nadprodukcji domeny wiążącej GluR2 w bakteriach Escherichia coli
Supervisor
Monika Wielechowska (FC/CDSB) Monika Wielechowska,, Chair of Drug and Cosmetics Biotechnology (FC/CDSB)Faculty of Chemistry (FC)
Certifying unit
Faculty of Chemistry (FC)
Affiliation unit
Chair of Drug and Cosmetics Biotechnology (FC/CDSB)
Study subject / specialization
, Biotechnologia
Language
(pl) Polish
Status
Finished
Defense Date
04-02-2019
Issue date (year)
2019
Reviewers
Joanna Cieśla (FC/CDSB) Joanna Cieśla,, Chair of Drug and Cosmetics Biotechnology (FC/CDSB)Faculty of Chemistry (FC) Monika Wielechowska (FC/CDSB) Monika Wielechowska,, Chair of Drug and Cosmetics Biotechnology (FC/CDSB)Faculty of Chemistry (FC)
Keywords in Polish
receptor glutaminergiczny, GluR2, nadprodukcja, białko opiekuńcze, Trigger factor
Keywords in English
glutamate receptor, GluR2, overexpression, chaperone, co-expression, Trigger factor
Abstract in Polish
Kwas glutaminowy jest istotnym neuroprzekaźnikiem pobudzającym w ośrodkowym układzie nerwowym. Poza udziałem w szybkim przekaźnictwie synaptycznym bierze on udział w regulacji wielu ważnych procesów takich jak proliferacja, migracja, różnicowanie niedojrzałych komórek nerwowych podczas rozwoju mózgu oraz w procesach uczenia się i zapamiętywania. Do głównych receptorów układu glutaminergicznego należą receptory AMPA. Selektywnym agonistą tych receptorów jest kwas α-amino-3-hydroksy-5-metylo-4-izoksazolopropionowy. Receptory AMPA są heterotetramerami zbudowanymi z czterech rodzajów podjednostek (GluR1, GluR2, GluR3, GluR4) ułożonych w różnych kombinacjach. Dotychczas prowadzone badania wykazały, że zaburzenia w funkcjonowaniu układu glutaminergicznego występują w chorobach neurodegeneracyjnych, w depresji, w epilepsji, a także w różnego rodzaju nowotworach. Z tego względu wciąż prowadzone są intensywne poszukiwania antagonistów tych receptorów, ponieważ mogą okazać się skutecznymi lekami na wyżej wymienione choroby. Badania nad oddziaływaniem potencjalnych antagonistów z receptorami, wykorzystujące linie komórkowe komórek ssaczych, niosą za sobą wysokie koszta. Z tego powodu do badania oddziaływania potencjalnych antagonistów wykorzystuje się preparaty rekombinowanych podjednostek receptorów glutaminergicznych otrzymywanych w bakteryjnych systemach ekspresyjnych. Ze względu na złą rozpuszczalność białek błonowych konieczne jest stosowanie odpowiednich metod pozwalających na otrzymywanie ich w postaci aktywnych preparatów. Za cel niniejszej pracy przyjęto zoptymalizowanie metody otrzymywania domeny wiążącej HS1S2 podjednostki GluR2 w formie umożliwiającej przeprowadzanie badań jej oddziaływania z potencjalnymi antagonistami. Nadprodukcję białka prowadzono w bakteriach E. coli wykorzystując metodę koekspresji białek opiekuńczych. Badania pokazały, że koekspresja czaperonu Trigger factor (Tf) pozwala na uzyskanie nadprodukcji domeny wiążącej HS1S2 GluR2 w formie rozpuszczalnej zdolnej do wiązania ligandów. Za pomocą chromatografii powinowactwa otrzymano preparaty HS1S2 o różnym stopniu czystości. Badanie zdolności otrzymanych preparatów do wiązania 3H-AMPA w obecności kwasu glutaminowego pozwoliły stwierdzić, że część z nich wykazuje zdolność do wiązania 3H-AMPA. Otrzymane wyniki pozwalają na wykorzystanie opracowanej metody do nadprodukcji domeny wiążącej HS1S2 zdatnej do zastosowania w badaniach nad nowymi antagonistami receptorów glutaminergicznych.
File
  • File: 1
    praca_inżynierska_-_Łężniak_Łukasz_-_276167.pdf
Request a WCAG compliant version
Local fields
Identyfikator pracy APD: 28356

Uniform Resource Identifier
https://repo.pw.edu.pl/info/bachelor/WUT56d991f2c25f4868ab6f8c508ed21a22/
URN
urn:pw-repo:WUT56d991f2c25f4868ab6f8c508ed21a22

Confirmation
Are you sure?
Report incorrect data on this page