Knowledge base: Warsaw University of Technology

Settings and your account

Back

Purification of recombinant mouse thymidylate synthase and its mutants by affinity chromatography

Karina Kalus

Abstract

Thymidylate synthase (TS) is symmetrical dimer catalyzing the reaction of conversion of deoxyuridine monophosphate (dUMP) to deoxythymidine monophosphate (dTMP, thymidylate) in the presence of a cofactor, methylenetetrahydrofolate, which serves as a donor of methylene group and a reducing agent. Thymidylate is subsequently phosphorylated to deoxythymidine triphosphate (dTTP) and used in DNA synthesis and repair. The reaction catalyzed by TS is particularly important in rapidly dividing cells such as tumor cells. Exhaustion of thymine causes a response termed thymineless stress, which, if prolonged, leads to cell death. For this reason, TS is a well-known molecular target in anticancer therapies. Previous studies on the structure of this enzyme allowed to indicate the amino acid residues involved in the binding of the substrate analog, N4-OH-dCMP, a strong TS inhibitor. To study the mechanism of interaction of this TS inhibitor, plasmid constructs with the TS gene were obtained containing nucleotide substitutions causing single point mutations: E81A, W103G, Y129F, L186G and H190A. For further research it is necessary to obtain homogeneous enzyme preparations as a result of induced overproduction of proteins in E. coli bacteria and isolation of these proteins using affinity chromatography. This engineering work was aimed at obtaining homogeneous preparations of mouse thymidylate synthase (mTS) - "wild" and five forms of this protein containing the above mentioned point mutations. The work included cultures of six strains of E. coli BL21 (DE3) and overproduction of six mTS protein forms in the 1,2-L scale. In order to obtain pure enzyme preparations, the procedure of removing the chaperone was carried out– as the first step, and then the experimental work was focused on the selection of the appropriate elution buffers system during protein purification by affinity chromatography on a nickel column. In order to purify enzyme preparations from non-protein contaminants, dialysis was carried out. The purification procedure was monitored on each step by determination of the amount of protein and mTS catalytic activity spectrophotometric methods. Finally, as a result of this work, significant amounts of 95-98% pure forms of preparations of six forms of mouse thymidylate synthase were obtained, that will be used for further studies on the mechanism of TS inhibition by N4-OH-dCMP.
Diploma type
Engineer's / Bachelor of Science
Diploma type
Engineer's thesis
Author
Karina Kalus (FC) Karina Kalus,, Faculty of Chemistry (FC)
Title in Polish
Oczyszczanie rekombinacyjnej mysiej syntazy tymidylanowej oraz jej mutantów z użyciem chromatografii powinowactwa
Supervisor
Joanna Cieśla (FC/CDSB) Joanna Cieśla,, Chair of Drug and Cosmetics Biotechnology (FC/CDSB)Faculty of Chemistry (FC)
Certifying unit
Faculty of Chemistry (FC)
Affiliation unit
Chair of Drug and Cosmetics Biotechnology (FC/CDSB)
Study subject / specialization
, Biotechnologia
Language
(pl) Polish
Status
Finished
Defense Date
04-02-2019
Issue date (year)
2019
Reviewers
Joanna Cieśla (FC/CDSB) Joanna Cieśla,, Chair of Drug and Cosmetics Biotechnology (FC/CDSB)Faculty of Chemistry (FC) Monika Wielechowska (FC/CDSB) Monika Wielechowska,, Chair of Drug and Cosmetics Biotechnology (FC/CDSB)Faculty of Chemistry (FC)
Keywords in Polish
mysia syntaza tymidylanowa, mutacje punktowe, inhibicja enzymatyczna, N4-OH-dCMP, chromatografia powinowactwa Ni-NTA
Keywords in English
mouse thymidylate synthase, point mutations, enzymatic inhibition, N4-OH-dCMP, Ni-NTA affinity chromatography
Abstract in Polish
Syntaza tymidylanowa (TS) jest symetrycznym dimerem katalizującym reakcję przekształcenia monofosforanu deoksyurydyny (dUMP) do monofosforanu deoksytymidyny (dTMP, tymidylanu) w obecności kofaktora, metylenotetrahydrofolianu, który jest donorem grupy metylenowej i reduktorem. Tymidylan ulega następnie fosforylacji, w wyniku której powstaje trifosforan deoksytymidyny (dTTP), wykorzystywany w syntezie i naprawie DNA. Reakcja katalizowana przez TS jest szczególnie ważna w komórkach szybko dzielących się, takich jak np. komórki nowotworowe. Wyczerpanie tyminy powoduje odpowiedź określaną terminem thymineless stress, która, jeśli jest długotrwała, prowadzi do śmierci komórki. Z tego względu TS jest znanym celem molekularnym w terapiach przeciwnowotworowych. Wcześniejsze badania nad strukturą tego enzymu pozwoliły na wskazanie reszt aminokwasowych zaangażowanych w wiązanie analogu substratu, N4-OH-dCMP, silnego inhibitora TS. W celu zbadania mechanizmu oddziaływania tego inhibitora TS uzyskano konstrukty plazmidowe z genem TS zawierające substytucje nukleotydowe powodujące pojedyncze mutacje punktowe: E81A, W103G, Y129F, L186G i H190A. Do dalszych badań niezbędne jest uzyskanie homogennych preparatów enzymatycznych w wyniku indukowanej nadprodukcji białek w bakteriach E. coli oraz izolacji tych białek z użyciem chromatografii powinowactwa. Niniejsza praca inżynierska miała na celu uzyskanie homogennych preparatów mysiej syntazy tymidylanowej (mTS) – „dzikiej” oraz pięciu form tego białka zawierających wymienione wyżej mutacje punktowe. Praca obejmowała hodowle sześciu szczepów bakterii E. coli BL21(DE3) oraz nadprodukcję sześciu form białka mTS w skali 1,2 L. W celu otrzymania czystych preparatów enzymatycznych w pierwszym etapie przeprowadzono procedurę usuwania białek pomocniczych (ang. chaperone), a następnie skupiono się na doborze odpowiedniego układu buforów myjących podczas oczyszczania białek metodą chromatografii powinowactwa na kolumnie niklowej. W celu oczyszczenia preparatów enzymatycznych z zanieczyszczeń niebiałkowych przeprowadzono dializę. Przebieg oczyszczania monitorowano oznaczając metodami spektrofotometrycznymi ilość białka i aktywność katalityczną mTS na każdym etapie procedury. Ostatecznie, w ramach niniejszej pracy uzyskano znaczne ilości czystych w ok. 95-98% preparatów sześciu form mysiej syntazy tymidylanowej, które będą użyte do dalszych badań nad mechanizmem inhibicji TS przez N4-OH-dCMP.
File
  • File: 1
    praca_inż-Kalus_Karina-276154.pdf
Request a WCAG compliant version
Local fields
Identyfikator pracy APD: 28340

Uniform Resource Identifier
https://repo.pw.edu.pl/info/bachelor/WUT283f74c868a34dc092295af5f46d3bcd/
URN
urn:pw-repo:WUT283f74c868a34dc092295af5f46d3bcd

Confirmation
Are you sure?
Report incorrect data on this page